ELISA检测乙肝抗体HBsAb概论
电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析_赵秀丽
·医学检验·2012年10月第19卷第28期乙型肝炎（hepatitis B，简称乙肝）是一种严重危害人类健康、传播广泛的病毒传染性疾病，据世界卫生组织报道，全球约有20亿人感染乙型肝炎病毒，每年有超过60万人死于乙型肝炎病毒所致肝硬化或肝癌[1]。
乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G，也就是常说的乙型肝炎病毒表面抗体（HB-sAb），它可以与表面抗原特异地结合，与人体的其他免疫功能共同作用消除掉病毒，保护人体不再受HBV的感染[2]。
所以，乙型肝炎表面抗体（HBsAb）是一种中和抗体，具有保护作用，它的检测是判断疫苗接种效果的重要指标[3]。
目前，乙型肝炎表面抗体的检测主要还依赖于酶联免疫吸附试验（ELISA）来判断是否阳性，并不能说明HBsAb是否能达到对机体的保护作用。
电化学发光法（ECLIA）作为一种新型标记免疫分析技术，在临床工作中也得到了越来越广泛的应用。
笔者2011年8～11月对本院536例HBsAb阳性的标本分别使用电化学发光法和ELISA方法进行检测，并对检测结果进行分析比较。
1材料与方法1.1标本来源选取沈阳医学院奉天医院2011年8～11月门诊和住院患者HBsAb为阳性的血液标本536份。
1.2仪器及试剂ECLIA采用Roche E170型全自动电化学发光免疫分析仪，HBsAb试剂盒、校准品、质控品均由Roche公司提供。
严格按照仪器和试剂说明书进行校准、质控、检测等操作。
ELISA法采用上海科华HBsAb试剂盒检测，实验仪器为安图酶标仪和洗板机。
所有试剂均在有效期内使用。
1.3阳性标准ECLIA法≥10IU/L为阳性；ELISA法按照说明书确定临界值：为2.1×阴性对照（阴性对照<0.05按0.05计算），每次标本测定值（S/CO）≥临界值为阳性。
1.4统计学处理数据采用SPSS11.0软件进行四格表分析。
乙肝表面抗体定性和定量两种检测方法相关性分析
乙肝表面抗体定性和定量两种检测方法相关性分析目的通过分析比较两种检测方法（ELISA法定性与电化学发光法定量）检测乙肝表面抗体（抗-HBs）的结果差异，探讨测定乙肝表面抗体（抗-HBs）的浓度值与定性检测结果s/co值之间的关系及对临床工作的指导意义。
方法用ELISA法定性与电化学发光法定量分别对96份标本进行检测分析。
结果电化学发光法结果在10mIU/ml判为阳性。
两种方法对乙肝表面抗体的对比检测结果分别见表1，表2。
由表1 、表2可以看出，HBsAb浓度值小于10mIU/ml和大于100mIU/ml 时，电化学发光法和ELISA法检测结果相近，用ELISA法基本能准确判定阳性和阴性。
但在10～100mIU/ml之间的标本电化学发光法共检测的36例阳性样本，ELISA法只有26例是阳性。
以10～50mIU/ml区段尤为显著。
整体来看电化学发光法检出阳性率为68.8%，ELISA法检测阳性率为59.3%。
2种方法检测差异显著，有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论在我国乙肝的感染率较高，由于HBsAb是一种保护性抗体，一旦人体受到隐性感染或经急性感染乙肝病毒并清除后，会产生HBsAb。
若人群接种乙肝疫苗后，机体也可产生HBsAb。
人体内的较高浓度的HBsAb可有效清除机体感染的乙肝病毒。
同时乙型肝炎又与肝癌的发生有密切的关系，因此，为防止乙肝的蔓延，要想达到控制乙型肝炎的的目的，就应该采用减少易感人群的方式。
据相关资料报道，HBsAb含量在10mIU/ml以上的人群并不都具有较强的免疫力。
HBsAb含量在10-100mIU/ml之间的人群对乙型肝炎的免疫力相对较弱，甚至不能预防乙肝病毒的感染。
相关资料表明只有HBsAb的含量大于100mIU/ml时，才具有抵抗乙肝病毒入侵的能力。
但也有研究者认为大于10mIU/ml可以用于个体免疫力强弱的评价[3]。
正是由于乙肝抗体定量检测的重要性，现在，很多实验室都开展了该项目的检测，它不仅能够判断是否需要接种乙肝疫苗还能对疫苗接种后的效果进行评估。
乙肝五项
李成静
乙肝五项（酶联免疫法ELISA)
两对半：
表面抗原HBsAg ① 表面抗体HBsAb ② e抗原HBeAg ③ e抗体HBeAb ④ 核心抗体HBcAb ⑤
检验原理
表面抗原HBsAg 表面抗体HBsAb e抗原HBeAg e抗体HBeAb 核心抗体HBcAb
夹心法
竞争法
双抗体夹心法
乙肝表面抗原检验原理
采用抗体包被反应板，加入待测样本， 经孵育后，加入酶标抗体，当样本中存 在抗原时，该抗原与包被抗体结合并与 酶标抗体结合形成抗体抗原酶标抗体复 合物，加入底物产生显色反应，反之则 无显色反应。
乙肝e抗体检验原理（竞争法）
采用抗原包被反应板，加入待测样本， 同时加入酶标抗体，与抗原形成竞争结 合，如待测样本中抗体含量高，则酶标 抗体与抗原结合少，加入底物时显色淡， 反之显色深。
检验方法
表面抗原（两步法）
1.配置洗液（25倍稀释）。 2.根据标本数排板，多加两孔作为阳性对照。 3.加75ul待测样本和阳性对照于反应孔中。 4.封板，置37℃加速仪温育40min。 5.取出反应板，不洗，每孔各加酶50ul（即一滴）。 6.封板置37℃加速仪温育20min。 7.取出反应板，洗液洗5次，清水冲洗，吸水纸上拍干。 8.每孔各加显色液A和B各一滴，混匀。 9.显色蓝色为阳性，无色为阴性。
谢谢Βιβλιοθήκη 后四项（一步法）1.根据标本数排板，加阳性对照一孔。 2.加入血清50ul和阳性对照于反应孔中，加酶一 滴。 3.封板，加速仪温育20min。 4.取出反应板，用洗液洗5次，清水冲洗，板拍 干。 5.每孔各加显色液A和B各一滴，混匀。
小鼠乙肝表面抗体(HBsAb)酶联免疫分析(ELISA)
小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗体（HBsAb）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）水平。
用纯化的小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）抗原包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗原的微孔中依次加入乙肝表面抗体（HBsAb），再与HRP标记的乙肝表面抗体（HBsAb）抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的乙肝表面抗体（HBsAb）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：90IU/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
ELISA检测HBsAb
结
果
• 黄色为阳性，无色为阴性 • 酶标仪测OD450
• 先观察阳性对照孔、阴性对照孔。待测样品孔 颜色与阳性孔同，则为阳性。或样品OD值/阴 性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。
酶 标 比 色 仪
• 酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光 度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的 适用于板、珠和小试管的设计。
• （3）酶反应的底物。
乙型肝炎病毒表面抗体的检测 ——双抗原夹心法测抗体
原
理
• 用HBsAg包被酶标板，加入待测标本，同时加 入HBsAg-HRP(辣根过氧化物酶) 。若标本中 存在HBsAb，则与包被HBsAg结合并与酶标 HBsAg结合形成HBsAg -HBsAb -酶标HBsAg 复合物，加入底物产生显色反应；反之则无显 色反应。
抗原： 抗体
1、表面Ag（HBsAg）
2、核心抗原（HBcAg）
HBsAb
HBcAb
3、e抗原（HBeAg）
两对半： HBsAg HBcAb HBeAg HBeAb HBsAb
Hg HBsAb HBcAb HBeAb + + + + + + + + + + + + HBV感染/无症状携带者 急性/慢性乙肝/无症状携带者
•
每孔加入显色剂A、显色剂B各一滴，充 分混匀，显色后每孔加入终止液一滴。
•
观察各孔颜色变化。
•
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤， 但却也决定着实验的成败。
•
ELSIA洗涤：清除残留在板孔中游离的物 质，以及非特异性地吸附的干扰物质，达 到分离游离的和结合的酶标记物的目的。
乙肝五项检测
乙肝五项检测（ELISA法）一、检测目的：乙型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。
二、测定原理：分别采用双抗体（抗原）夹心法和竞争法。
HBsAg、HBsAb原理：采用单克隆抗-HBs(HbsAg)包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP(HBsAg-HRP),当标本中存在HBsAg（HBsAb）时，该HBsAg（HBsAb）与包被抗- HBsAg（HBsAb）结合并与抗- HBsAg-HRP （HbsAb-HRP）结合形成抗- HBsAg（HBsAb）-抗- HBsAg-HRP（HBsAb-HRP）复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAg原理：采用抗-HBe包被反应板，加入待测标本，同时加入抗—HBe-HRP，如待测样本中抗HBeAg时，就与包被抗-HBe、抗—HBe-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAb原理：采用抗-HBe、HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBe含量高，则抗—HBe-HRP 与HBeAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
HBcAb原理：采用基因工程重组HbcAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBc含量高，则抗—HBc-HRP 与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
三、操作步骤：1、将试剂从冷藏室中取出，30分钟后平衡至室温方可开启使用。
2、用蒸馏水将PBST浓缩液20倍稀释，作为洗液。
3、将微孔条固定于支架上，按序编号。
4、按具体使用试剂盒说明书加样、孵育、洗板、显色。
9、用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白调零，然后读取各孔OD值。
四、结果判断：样品OD值／阴性对照平均OD ≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。
ELISA法在乙肝两对半测定中的质量控制分析
ELISA法在乙肝两对半测定中的质量控制分析摘要分析酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测乙型肝炎（乙肝）两对半的检验步骤，总结检测全程的相关影响因素。
检测前标本的准备、试剂盒的影响、检验人员的业务水平、检测过程中的标准操作规程、检测结果的解讀等是ELISA 法检测乙肝两对半的相关影响因素。
ELISA法是检测乙肝两对半的灵敏方法，严格遵循操作规程，加强质量控制，可有效排除相关影响因素的干扰，为乙肝的临床诊疗提供有力依据。
关键词乙肝两对半；酶联免疫吸附实验；质量控制我国的乙肝病毒目前感染率大概占到总人群的60%～70%，这其中乙肝表面抗原携带人群占总人口的7%左右，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙肝患者约2000万例[1-3]。
乙肝两对半作为现阶段临床诊断、治疗乙型病毒性肝炎及观察疗效的重要实验室指标，主要使用ELISA进行检测，其灵敏度高，但在其检测过程中影响因素较多，易导致假阳性或假阴性结果[4]。
因此在实际工作中，临床实验诊断过程中需要加强实验室的科学管理，不断强化检测的标准流程，加强实验室诊断的质量控制，为患者提供准确的检验结果，有利于疾病的早期诊断和治疗，同时减少医患纠纷等问题。
1 检测前的质量控制1. 1 标本的准备检测前应该保证标本无溶血现象，因为溶血导致红细胞破裂后会将体内过氧化物酶活性物质释放，这种过氧化物酶活性物质会和显色剂发生显色反應，影响显色比对；患者血块完全收缩也可能致使待检标本中的非特异性活性物质出现部分或者完全失活的情况发生[1]，尤其是在血液标本尚没有完全凝固的状态下，若强行对血清进行分离处理会导致纤维蛋白块形成，极易导致检测结果的假阳性。
此外患者基本信息的核对也是标本准备质量控制中至关重要的一步。
1. 2 试剂盒的影响选择的试剂盒，其质量是保证实验诊断结果准确性、特异性的必要前提。
但需要临床检验人员注意的是，目前市场上不同厂家的试剂盒在特异性、准确性、稳定性以及特异性存在一定差异，因此在实际操作过程中，要求试剂盒保存在4℃左右的环境下，并且需在测定前将试剂盒放置于室温进行平衡处理约0.5～1.0 h[5]。
酶联免疫分析法(ELISA)在乙肝两对半检测中的应用价值
酶联免疫分析法(ELISA)在乙肝两对半检测中的应用价值发表时间：2013-06-03T14:48:23.297Z 来源：《医药前沿》2013年第9期供稿作者：张玉花[导读] 使用SPSS17.0软件对本次医学研究数据进行统计学分析。
张玉花(四川省阿坝州九寨沟县疾病预防控中心检验科 623400) 【摘要】目的探讨酶联免疫分析法(ELISA)在乙肝两对半检测中的应用价值。
方法本次医学观察选取本院2011年1月至2012年12月之间收治的200例门诊体检患者为观察对象，所有患者均接受酶联免疫分析法和乳胶层析法检测，回顾分析患者乙肝两对半检测结果。
结果两组检查方法中，HBeAb、HBeAg和HBsAg检查结果对比无明显统计学差异（P>0.05）；HBcAb和HBsAb检查结果对比统计学差异明显（P<0.05）。
结论由本次临床研究结果可知，酶联免疫分析法用于乙肝两对半检测，具有较高的敏感性和特异性，有助于乙肝病毒的进一步检测，因而临床应用价值较高。
【关键词】酶联免疫分析法乙肝两对半检测【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）09-0145-01 近年来，乙型肝炎在我国发生率呈现出了逐渐上升的趋势，该疾病的发生会给患者的健康和正常生活造成较为严重的负面影响，因而应得到及时有效的预防和治疗。
乙肝两对半是现阶段应用率最高的一种乙型肝炎病毒血清检测指标，对于献血人员检查、流行病学调查和乙肝防治具有十分重要的意义。
本次临床研究对酶联免疫分析法在乙肝两对半检测中的应用价值进行了分析，现将本次临床研究结果报道如下。
1 资料和方法1.1 临床资料本次医学观察选取本院2011年1月至2012年12月之间收治的200例门诊体检患者为观察对象，男性130例，女性70例，患者年龄范围在28岁至62岁不等，平均年龄（44.5±15.6）岁。
1.2 方法使用上海科华生物技术有限公司生产的乙肝两对半试剂盒作为本次临床研究的检测试剂；使用美国伯乐公司生产的1575型洗板机和680型酶标仪作为本次临床研究仪器。
乙肝五项测定-ELISA(1)
HBsAg HBsAb HBeAg
夹心法
HBeAb HBcAb
竞争法
底物 显色
+
-
？
？？？
免疫反应模式
图1 双抗体夹心法ELISA原理图
竞争
固（待相H测BcA抗Agb体）+ （酶待H标B检c抗Ab体A）b + AbE
HBcAEb检E测
思考：
1.各诊断试剂盒中哪些成分可以交叉使用？
结果判定： 与对照比较后依据判定标准报告
夹心法：
竞争法：
阳性：显色 阴性：不显色
阳性：不显色 阴性：显色
报告：
1号血清， HBsAg（-） HBsAb（+） HBeAg（-） HBeAb（-） HBcAb（-）
检测方法：ELISA
注意：
1.溶血标本会影响结果准确性； 2.ELISA双抗体夹心法，类风湿因子会干扰实验；
底物
显色
固相抗原 HBcAg
温育 洗板
E
温育
E
图2 竞争
2. 诊断试剂：乙肝五项商品试剂盒
HBsAg商品试剂盒 HBeAg商品试剂盒 HBcAb商品试剂盒
HBsAb商品试剂盒 HBeAb商品试剂盒
3. 其他材料：
（1）37℃培养箱、微量移液器等。 （2）蒸馏水等。
操作方法：
1 分离血清、配制洗涤液
2 编号
样本 1~20
3 加样
50μl
阴性 对照 50μl
阳性 对照 50μl
空白 对照
—
1d 4 加酶结合物
1d
1d
—
振荡混匀
5 温育 6 洗涤
酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒表面抗原
xx医科大学附属第五医院 xx
乙肝五项报告单
教学目标
• 掌握ELISA检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的原理
酶联免疫吸附试验
技术简介
• 酶联免疫吸附试验：ELISA • 是一种固相酶免疫分析技术 • 即可检测抗原，又可检测抗体 • 广泛地应用于临床和科研检测 • 反应类型：双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法…
固相载体（聚苯乙烯塑料） E E 酶标记乙肝表面抗体
乙肝表面抗体 血清中待测乙肝表面抗原
底物（底物缓冲液+ 底物液）
水浴箱37℃温育
血清中其他非待测抗原
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图 1、特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体
包被 固相乙肝表面抗体
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图 2、加入待测标本，温育，形成固相抗体-待测抗原复合物
抗原抗体反应具有高度的特异性
酶联免疫吸附试验
如何应用双抗体夹心法检测HBsAg?
双抗体夹心法
方法简介
• 是ELISA检测抗原最常用的方法 • 适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原
双抗体夹心法
检测HBsAg三个必要试剂
• 固相化的抗体 • 酶标记的抗原 • 酶反应的底物
双抗体夹心法
反应基本原理
课后思考题
• 试着分析乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）的检测原理？
提示：双抗原夹心法
EE
EE
EE
EE
固相乙肝表面抗体-待测乙肝表面抗原-酶标乙肝表面抗体复合物
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图
6、加底物，固相载体结合的酶催化底物显色
乙肝实验报告
一、实验背景乙型肝炎（Hepatitis B）是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏感染疾病，具有高度传染性。
乙型肝炎病毒主要通过血液、性接触和母婴垂直传播。
乙型肝炎病毒感染可分为急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎。
急性乙型肝炎多数病例可自愈，而慢性乙型肝炎则可能导致肝硬化、肝细胞癌等严重后果。
为了了解乙型肝炎病毒的感染情况和病毒复制水平，本实验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了乙型肝炎病毒五项指标，包括乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）和乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）。
二、实验目的1. 检测乙型肝炎病毒感染情况，判断患者是否为乙型肝炎病毒感染者。
2. 评估病毒复制水平，为临床诊断和治疗提供依据。
三、实验方法1. 标本采集：采集患者血清，置于-20℃冰箱保存。
2. 试剂与仪器：乙型肝炎病毒五项检测试剂盒（ELISA法）、酶标仪、移液器、离心机等。
3. 实验步骤：1. 将试剂取出室温平衡30分钟。
2. 按照试剂盒说明书进行操作，包括加样、孵育、洗涤、显色等步骤。
3. 使用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD值）。
4. 根据标准曲线计算各指标的含量。
四、实验结果1. HBsAg阳性，表明患者为乙型肝炎病毒感染者。
2. HBsAb阴性，表明患者未产生保护性抗体。
3. HBeAg阳性，表明病毒复制活跃。
4. HBeAb阴性，表明病毒复制尚未停止。
5. HBcAb阳性，表明患者曾感染或正在感染乙型肝炎病毒。
五、分析与讨论1. 本实验结果显示，患者为乙型肝炎病毒感染者，病毒复制活跃，可能存在慢性乙型肝炎的风险。
2. 患者未产生保护性抗体，建议接种乙型肝炎疫苗，以提高免疫力。
3. 患者HBcAb阳性，表明曾感染或正在感染乙型肝炎病毒，需进一步检查肝功能，以评估肝脏损伤程度。
六、结论本实验采用ELISA法检测了乙型肝炎病毒五项指标，结果表明患者为乙型肝炎病毒感染者，病毒复制活跃。
ELISA法检测乙肝五项的影响因素与临床意义
ELISA法检测乙肝五项的影响因素及临床应用【摘要】众所周知，乙肝的致病原是乙肝病毒，乙肝病毒在肝细胞内生存、复制后，再排出到血液中。
所以不仅血流中病毒高负荷，而且肝脏的大多数肝细胞都被感染。
当今社会谈乙肝色变，主要有下列几个方面：长期病毒携带或患病怕传染给亲属和周边的人群，同时亦担心受到社会的歧视；治疗乙肝和各种护肝药名目繁多，且各有利弊而不知所从；长期病毒携带或久治不愈而演化成肝硬化甚至肝癌。
作为检测乙肝五项的工作人员应该慎重操作，对每一个结果负责，不能因假阳性引起患者的心理压力和精神痛苦，造成不必要的纠纷。
【关键词】ELISA法；乙肝两对半；乙肝两对半又称乙肝五项，为国内常用的乙肝病毒(HBV)感染的检测血清标志物。
乙肝病毒免疫学标记有表面抗原(HBsAg)、表面抗体(抗-HBs或HBsAb)、e抗原(HBeA g)和e 抗体(抗-HBe或HBeAb)、核心抗原(HBcAg)和核心抗体(抗-HBc或HBcAb)”。
可检测患者是否感染乙肝及感染的具体情况。
随着现代临床免疫学的发展，酶联免疫吸附试验(ELISA) 因其操作简单、灵敏度高、特异性高等特点而广泛应用于乙肝五项的检测。
但由于乙肝标志物检测生产试剂厂家较多，各种试剂诊断灵敏度及特异性相差很大，因此，如何选择灵敏度高、特异性好的乙肝标志物检测试剂成为乙肝检测中至关重要的问题之一。
本研究分别选择3家国产ELISA试剂盒对来甘肃省武威肿瘤医院参加健康体检患者血液样品进行乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测，乙肝表面抗原(HBsAg)检测试剂盒，通过ELISA法检测300例健康体检患者血清中HBsAg水平，检测出的阳性标本再用免疫胶体金试纸条检测，比较三个不同公司生产试剂盒检测阳性率及与金标试纸条法检测的一致性，现报道如下：1资料与方法1 ．1一般资料选择我院2013年7月——2 013年11月健康体检患者300例，其中，男170例，女130例；年龄20～54岁，平均30岁。
电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析
ＥＬ Ｉ ｗａ ｉｈ ｒｔ ａ ｈ ｔｏ １ Ａ．Ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｔ Ｌ Ａ，ｔ ｅ ａ ｃ ｒｃ ，ｓ ｅ ｉ ｃｔ，ａ ｃ ｒ ａ ｃ ａｅ ｏｉｉｅ ｐ ｅ ｉ ｖ Ｃ Ａ ｓｈ ｇ ｅ ｈ ｎ ｔａ ｆＥＬ Ｓ ｏ ａ ｅ ｏ ＥＣ Ｉ ｈ ｃ ｕ ａ ｙ ｐ ｃｆ ｉ ｉ ｙ ｃ ｏｄ ｎ ｅ ｒｔ，ｐ ｓｔ ｒｄ ｔ ｅ ｖ ｉ
［ 中图分 类 号】 ４ ６６ Ｒ ４ ．
【 文献 标பைடு நூலகம் 码】 Ａ
【 章编 号】 ６ ４ ４ ２ （ ０ ２）０（ 一 ０ ４ ０ 文 １ ７ — ７ １ ２ １ １ ａ） ０ ９ — ２
Ｃｏ ｐ ｒｓ ｎ ｏ ｅ ｕ ｔ ｆＨＢｓ ｅ ｅ ｔ ｄ ｂ ｍ ａ ｉｏ ｆｒ ｓ ｌｓｏ Ａｂ ｄ ｔ ｃ ｅ ｙ ＥＣＬＩ ａ ｄ ＥＬＩ Ａ Ａ ｎ Ｓ
取沈 阳 医学 院奉 天医 院 ２ １ ０ １年 ８ １ 门诊 和住 院部 送检 的 Ｈ ｓ ｂ为 阳性 的血 液标 本 ５ ６份 ， 别 进行 Ｅ ＬＡ 法 ～ １月 ＢＡ ３ 分 ＣＩ 和 Ｅ ＩＡ法 进 行 检 测 ，并 对 结 果 进 行 分 析 。 结 果 Ｅ ＬＡ 检 测 ＨＢ Ａ ＬＳ ＣＩ ｓ ｂ在 ｌ ～ ０ Ｉ ， ０ ５ Ｕ Ｌ时 ， Ｌ Ｓ 的 阳性 率 只 有 Ｅ ＩＡ ６６ ％ ， 明 Ｅ ＩＡ方法 的 灵敏 度 不如 电化学 发光法 高 。与电 化学 发 光法 比较 ， ＬＳ ． ２ 说 ＬＳ Ｅ ＩＡ方 法 的敏感 性 为 ４ ．４ 特 异 １ ％， ２ 性 为 ９ ．４ ， 合 率为 ４ ． ％， ８０ ％ 符 ６６ ４ 阳性 预测 值 为 ９ ．０ 阴性 预 测值 为 １ ． ％。 结论 在 临 床常 规检 测 标本 中 ， ９５ ％， ２９ ９ 电化
ELISA法检测血清中乙肝病毒表面抗体虚拟实验笔记
ELISA法检测血清中乙肝病毒表面抗体虚拟实验笔记
（实验主编：杨健，川北医学院）
实验一：肘静脉采血与分离血清
实验原理：带受试者完成三针乙肝疫苗免疫接种两个月后，对其进行肘静脉采血，将血液样本静置后离心分离血清用于检测乙肝病毒表面抗体，以判断乙肝疫苗的免疫效果
实验相关设备介绍：器材和试剂
采血针，压脉带，真空采血管，离心机，1000ul移液器，天平，-20℃冰箱，2ml离心管，恒温培养箱，无菌棉签，75%酒精，碘酒，采血垫
实验操作：
点击采血垫→压脉带→握拳→碘酒→酒精→采血针→真空采血管→压脉带→无菌棉签→培养箱→离心机→签字笔→移液枪→冰箱
实验二ELISA法检测血清乙肝病毒表面抗体
实验操作
血清样本→HBsAb阳性对照血清→HBsAb阴性对照血清→HBsAb酶标记抗原
酶标抗原添加1-5孔（左到右）→封口膜→培养箱→酶标板（每孔加入300ul洗涤液，轻晃酶标板1min，弃去，在吸水纸上拍杆，如此重复共洗涤5次）
点击洗涤液→加入1-6孔→酶标板晃动→吸水纸→底物A(1-6孔）
底物B→晃动标板→封口膜→终止液→晃动酶标板→酶标仪。
ELISA检测乙肝抗体
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方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml， 4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及 阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈 颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后 测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
链接后，仞
测物质的量直接相关，故跟据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
(三) 试剂器材 1. 试剂 (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO３ 1.59克 NaHCO３ 2.93克 加蒸馏水至1000ml (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO４· 12H2O 2.9克 NaCl 8.0克 KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml (3) 稀释液： 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 (4) 终止液(2M H２SO４）： 蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸): 0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml 0.1Ma 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
酶联免疫吸附实验-乙肝两对半测定
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注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染； 假阳性
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+ 急性HBV感染后康复
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－ HBV感染后已恢复
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既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复 期
既往感染未能测出HBsAb；恢复期
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－－
+ HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症
状HBsAg携带者
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－ － － 过去和现在未感染过HBV
常见模式及临床意义
HBsAg HBsAb
HBeA g
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HBeA b
HBcAb
临床意义
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急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV 复制，传染性强－大三阳
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急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg 携带者；传染性弱－小三阳
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急性HBV感染；慢性HBsAg携带者； 传染性弱
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慢性HBsAg携带者易转阴；急性HBV 感染趋向恢复
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急性HBV感染早期或慢性携带者，传 染性强
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急性HBV感染早期；急性HBV感染潜 伏期；慢性HBV携带者，传染性弱
常见模式及临床意义
ELISA法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义_薛春杨
中国误诊学杂志2011年6月第11卷第16期Chin J Misdiagn,Jun 2011 Vol 11 No.16 · 3913 ··医学论坛 ·ELISA 法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义薛春杨,周建波东南大学医学院附属江阴医院检验科,江苏江阴214400摘要:目的探讨ELISA法检测乙肝两对半常见影响因素和临床意义。
方法回顾分析ELISA法检测乙肝两对半的检验步骤,总结乙肝两对半检测的影响因素,并对临床意义进行探讨。
结果检验前标本的准备、检验人员的业务水平、检验过程中的标准操作规程、检验结果的研读等是ELISA法检测乙肝乙肝两对半的影响因素,两对半各项指标对临床诊治乙肝具有指导意义。
结论乙肝两对半是乙肝临床治疗依据的重要指标,ELISA法是检测乙肝的灵敏方法,严格按照操作步骤,加强质量控制,可有效排除影响因素干扰。
主题词:肝炎,乙型/诊断;肝炎抗体,乙型/分析;肝炎抗原,乙型/分析;酶联免疫吸附测定中图分类号:R512.62 文献标识码:B 文章编号:1009-6647(2011)16-3913-02乙肝两对半是诊断、治疗乙肝的有效指标,常用的检测方育,温育使反应孔内的酶标物质辣根酶催化底物生成有色产。
、,ELISA 法检测乙肝两对半的影响因素和临床意义进行探讨, 为37 ℃ 10～40 min反应彻底完成,底物液受光照会自行变色,显临床诊疗提供参考。
色反应需在避光环境进行。
2 .4显色显色是ELISA法测定乙肝两对半中最后一步温1 检测前的影响因素1 .1 标本的影响标本应避免溶血, 红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰与显色剂发生显色反应。
血块完全收缩使标本中的非特异性活性物质部分或全部失活,若在血液还未开始凝固时强行离心分离血清,EL ISA测定过程中可形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果[2]。
1 .2 试剂盒的影响试剂盒的质量是保证实验结果准确性的必要前提,各厂家的试剂盒灵敏度、特异性、精密度、稳定性和操作简便性有一定的差异。
elisa检测hbsab实验报告
elisa检测hbsab实验报告ELISA 检测 HBsAb 实验报告一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中乙型肝炎表面抗体（HBsAb）的水平，以评估个体对乙型肝炎病毒（HBV）的免疫状态。
二、实验原理ELISA 是一种基于抗原抗体特异性结合反应的检测方法。
在本实验中，将乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包被在微孔板上，形成固相抗原。
加入待检血清后，其中的 HBsAb 会与固相抗原结合。
随后加入酶标记的抗人免疫球蛋白（二抗），形成抗原抗体酶标二抗复合物。
最后加入底物，通过酶催化底物显色，根据显色的强度来定量测定血清中HBsAb 的含量。
三、实验材料与设备1、试剂乙型肝炎表面抗原（HBsAg）ELISA 试剂盒，包括包被有 HBsAg的微孔板、酶标记的二抗、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液等。
待检血清样本。
酶标仪。
移液器。
恒温箱。
四、实验步骤1、准备工作将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温（约 20-25℃）。
配制洗涤液：将浓缩洗涤液用蒸馏水按规定比例稀释。
2、加样设空白孔、阴性对照孔、阳性对照孔和样品孔。
空白孔不加任何物质，阴性对照孔和阳性对照孔分别加入阴性对照和阳性对照血清，样品孔加入待检血清，每孔100μL。
血清样本需先用样品稀释液按一定比例稀释。
3、温育将微孔板放入恒温箱中，37℃温育 30 分钟。
4、洗涤小心吸出孔内液体，用洗涤液洗涤微孔板 5 次，每次浸泡 30 秒，然后拍干。
除空白孔外，每孔加入酶标记的二抗100μL。
6、温育再次将微孔板放入恒温箱中，37℃温育 30 分钟。
7、洗涤重复洗涤步骤 4。
8、显色每孔加入显色液 A 和显色液 B 各50μL，轻轻振荡混匀，室温避光显色 15 分钟。
9、终止每孔加入终止液50μL，终止反应。
10、测定使用酶标仪在 450nm 波长处测定各孔的吸光度（OD 值）。
五、实验结果1、结果判断以空白孔调零，读取各孔的 OD 值。
elisa法检测抗体的原理
elisa法检测抗体的原理今天咱们来聊一个特别有趣的东西，叫elisa法检测抗体。
这听起来可能有点复杂，但是别担心，就像玩游戏一样，我们一步步来理解它。
想象一下，我们的身体就像一个超级大的城堡，里面住着很多小卫士，这些小卫士就是抗体。
有时候，会有一些小坏蛋，像病菌啊，闯进我们的城堡。
这时候，抗体小卫士们就要出来和小坏蛋战斗啦。
那elisa法呢，就像是一个聪明的小侦探，专门来找这些抗体小卫士的。
这个小侦探的工作地方是一块小小的板子，就像我们玩游戏的小棋盘一样。
这个板子上有很多小坑坑，每个小坑坑都是一个小房间。
我们把可能含有抗体的东西，比如说从生病的小朋友身体里取出来的一点点血液或者其他的液体，放到这些小房间里。
这就好比把一群小朋友放进了不同的小房子里，每个房子里可能有我们要找的抗体小卫士哦。
然后呢，这个聪明的elisa小侦探会给每个小房间里放一种特别的东西，这种东西就像小磁铁一样，它特别喜欢和抗体小卫士抱在一起。
比如说，要是抗体小卫士穿着红色的衣服，那这个特别的东西就只喜欢抱穿红色衣服的小卫士。
再接下来，小侦探又会往小房间里放另一种东西，这种东西就像会发光的小星星一样。
这个小星星很神奇，它能紧紧地粘在之前和抗体抱在一起的那个东西上。
现在呢，要是这个小房间里有抗体小卫士，那这个小房间就会变得亮晶晶的，就像里面藏了很多小宝藏一样。
但是如果小房间里没有抗体小卫士，那就不会亮晶晶啦。
就像我们在草丛里找小虫子一样。
我们先在草丛里找可能藏着小虫子的地方，然后用一个小工具把小虫子吸引出来，再用一个亮晶晶的东西标记一下小虫子在的地方。
如果有亮晶晶的地方，那就说明这里有小虫子，也就是有我们要找的抗体啦。
ELISA检测乙肝抗体HBsAb
结果观察
结果观察
乙型肝炎病毒采用ELISA检测法具有操作简便、灵敏度高、试 剂成本低、环保和适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点, 目前在国内实验室被广泛使用。 缺点易产生假阳性结果。
酶标仪洗板机
排枪加样
酶标仪
乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）
抗原,抗体: 1、表面Ag（HBsAg） HBsAb 2、核心抗原（HBcAg） HBcAb 3、e抗原（HBeAg） HBeAb
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
竞争法
用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面， 经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混 合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底 物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知 抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位就可， 因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此 法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程， 但需用较多量的酶标记抗原。
酶
酶具有高效催化性：可以加快化学反应的速度 ；在反应前后， 没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作用。
Y
DH2 + H2O2 无色
酶
D + 2H2O 有色
酶联免疫吸附试验 用于检测可溶性抗 原或抗体
酶免疫技术
酶免疫组化法 用于检测组织中或 细胞表面的抗原
酶联免疫吸附试验-ELISA
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 方法中有三个必要的试剂：
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急性感染趋向恢复（小三阳）
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既往感染恢复期
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既往感染恢复期
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既往感染或“窗口期”
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既往感染或接种过疫苗
两对半： HBsAg HBsAb HBcAb HBeAg HBeAb
HBV-Ag、Ab检测结果临床分析
HBsAg HBeAg
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HBsAb HBcAb HBeAb
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HBV感染/无症状携带者
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急性/慢性乙肝/无症状携带者
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急性/慢性乙肝
（传染性强，大三阳）
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这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位就可， 因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此 法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程， 但需用较多量的酶标记抗原。
➢ 操作步骤 1.从冰箱取出试剂盒，室温平衡30分钟。 2.按如下方式加待测血清，每孔1滴。
待1 待2 待3 阳性 阴性 空白
3.每孔加酶结合物1滴（孔上方悬空滴加，无气泡），混匀， 空白孔不加，置37度温箱30分钟。 4.取出反应板，弃液，拍干。 5.每孔注满洗涤液，（不要溢出）静置5秒后弃液，拍干， 重复洗涤5次，拍干。 6.每孔加显色剂A和B各1滴，置37度温箱15分钟。 7.每孔加终止液1滴混匀，观察结果。
放射免疫技术
免疫荧光技术
酶免疫技术
酶免疫技术
用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 可用酶标测定
仪测定光密度（OD）来反应抗原或抗体含量，灵敏度可达到
ng-pg/ml水平。
Y
酶
酶
DH2 + H2O2
D + 2H2O
无色
有色
酶具有高效催化性：可以加快化学反应的速度 ；在反应前后， 没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作用。
间接法
将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；
加酶标抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；
加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原 就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂" （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，3）酶反应的底物。
ELISA的类型
间接法（测抗体） 双抗体夹心法（测大分子抗原） 竞争法（测小分子抗原）
酶联免疫吸附试验-ELISA
➢ 实验原理
抗原或抗体吸附到固相载体表面后，以及抗原抗体与 酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物 时，在酶的催化下引起底物水解显色。产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定 性或定量分析。
此法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但 其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。因此，这 项技术目前正越来越广泛地被应用到医学的各个领域中。
双抗体夹心法
酶标抗体
血清样品 或参比品
底物
特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 酶量与标本中受检物质的量成正相关；
酶标仪测定OD值
加底物：夹心式复合物中的酶催化 底物成为有色产物
终止液
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量
酶免疫技术
酶联免疫吸附试验
用于检测可溶性抗 原或抗体
酶免疫组化法
用于检测组织中或 细胞表面的抗原
酶联免疫吸附试验-ELISA
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记； 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物； 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定 性或定量分析。
➢ 结果观察
➢ 结果观察
乙型肝炎病毒采用ELISA检测法具有操作简便、灵敏度高、试 剂成本低、环保和适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点, 目前在国内实验室被广泛使用。 缺点易产生假阳性结果。
酶标仪洗板机
排枪加样 酶标仪
乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）
抗原,抗体: 1、表面Ag（HBsAg） HBsAb 2、核心抗原（HBcAg） HBcAb 3、e抗原（HBeAg） HBeAb
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
竞争法
用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面， 经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混 合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底 物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知 抗原的量。
ELISA检测乙肝抗体
第三小组
肝表面抗体ELISA检测
➢ 实验目的
1.掌握ELISA的原理和操作方法。 2.熟悉酶标仪的使用方法。
免疫标记技术 免疫标记技术是用荧光素、酶、或者放射性核素等标记抗体或 抗原，利用标记技术的高度敏感性进行的抗原抗体的反应。
标记物
Y
细胞1
细胞2
分类
荧光素
放色性核素
酶