酶工程蛋白质的改造.
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蛋白质的改造
对蛋白质分子的改造主要包括2个方面：
•蛋白质分子的理性改造
•蛋白质分子的非理性改造
非理性改造+筛选=定向进化
蛋白质的理性改造
• 定点突变
• 拼接
• 重头设计
基于Dpn I的快速定点突变方法
盒式突变：
利用目标基因序列 中适当的限制酶切 位点，插入各种合 适的突变DNA片段， 用以取代目标基因 中特定DNA片段。
1. DNaseI产生随机片段；
2. 随机片段变性；
3. 随机片段复性；
4. 延伸
反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
体外随机重组法(RPR)
体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模 板，配合一套随机序列引物，先产生大量互 补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的 错配和错误引发，这些短DNA片断中也会有少 量的点突变。在随后的PCR反应中，它们互为 引物，合成出较长的片断，最终组装成完整 的基因长度，形成基因多样性文库。
通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可 以生物合成C端带有硫酯键或N端带有半胱氨酸的蛋白 质分子。两种蛋白混合后，硫酯键和半胱氨酸发生自 发连接反应，形成肽键，从而将两种蛋白连接起来。
全新蛋白质设计
指基于对蛋白质折叠规律的认识，从 氨基酸的序列出发，设计制造自然界种 不存在的全新蛋白质，使之具有特定的 空间结构和预期的功能。
Random Chimeragenesis on Transient Templates (RACHITT)
渐增切割法产生杂合酶
Incremental Truncation for Creation of Hybrid Enzyme, ITCHE 用核酸外切酶III分别消化两个非高度同 源的靶基因，控制切割速度不大于10bp/min， 每隔很短时间连续取样，迅速终止样品反应， 以获得一组一次有几个甚至一个bp缺失的片断， 然后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生 杂和基因文库。
蛋白质的定向进化
蛋白质分子定向进化的原理 蛋白质分子定向进化的策略 蛋白质分子定向进化的应用
一、蛋白质分子定向进化的原理
所谓蛋白质分子的体外定向进化，又称 实验分子进化，属于蛋白质的非理性设计， 它不需事先了解蛋白质分子的空间结构和催 化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟 自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)， 在体外随机改造蛋白质基因，并定向选择出 所需性质的突变蛋白质分子。
Directed evolution
1、突变文库的建立
易错PCR(Error Prone PCR)
采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过 调整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离 子，改变体系中四种dNTP的浓度等，改变Taq酶 的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变。 连续易错PCR是将一次PCR扩增得到的突变 基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进 行随机诱变。
DNA改组 (DNA shuffling)
DNA改组是对一组同源基因进行体外随机重 组的特殊PCR技术，又称为基因洗牌术。
用DNaseI消化不同来源的的同源DNA，接着 将这些小片断进行无引物的PCR扩增，在此过程 中，随机片断之间互为模板和引物进行扩增， 直到获得全长基因，形成突变文库。
融合表达
将2个或多个不同 的模块连接成一 个大分子，起连 接作用的氨基酸 片断为融合蛋白 接头（linker）。
如：(GGGGS)3
内含肽介导的蛋白质连接
Intein是一个自我拼接的蛋白质元件，类似于基 因组中的内含子intron在RNA的剪接中所起的重要作 用。Intein如同一个插入前体蛋白的肽段，进行自 我切除，并用一个肽键将两端的蛋白（extein）连 接起来。
Hale Waihona Puke Baidu
定向进化 = 非理性改造+ 筛选
前者是人为引发的，后者虽相当于环 境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的 作用，整个进化过程完全是在人为控制下 进行的。
二、蛋白质分子定向进化的策略
定向进化是由一个靶基因或一群相关 的家族基因起始创建分子多样性(突变和/ 或重组)文库，然后对该多样性文库的基 因产物进行筛选，那些编码改进功能产物 的基因被利用来继续下一轮进化；重复这 个过程直到达到目标。
理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜 力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定 向进化的基本先决条件。 体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工 程学的研究和应用范围，特别是能够解决合 理设计所不能解决的问题，为蛋白质分子的 结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且在 工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。
2、突变文库的筛选
表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和生
存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活 性的筛选方法，主要依据强发色体底物(颜色变化)、易观 察的克隆表现(溶解圈)或荧光产物来筛选突变体。
高通量筛选蛋白质突变体库的方法：
如表面展示技术。
噬菌体表面展示技术
Phage display techniques
交错延伸法(StEP)
交错延伸(staggered extension process, StEP)是一种简化的DNA改组技术，它是在PCR 反应中，将含不同点突变的模板混合，随之进 行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮 中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含 不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而 实现不同模板间的重组，如此重复直至获得全 长基因片段，结果产生相间的含不同模板序列 的新生DNA分子。
不依赖于DNA序列 同源性
无活性重组
不依赖同源序列的蛋白质重组
（sequence homology independent protein recombination, SHIPRE）
将2个靶基因串联在同一载体上；PCR 将α–硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物 中；用核酸外切酶III处理产生不同截短程 度的DNA片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基 因长度相似的随机片断，与表达载体连接 重组，形成杂合文库。
对蛋白质分子的改造主要包括2个方面：
•蛋白质分子的理性改造
•蛋白质分子的非理性改造
非理性改造+筛选=定向进化
蛋白质的理性改造
• 定点突变
• 拼接
• 重头设计
基于Dpn I的快速定点突变方法
盒式突变：
利用目标基因序列 中适当的限制酶切 位点，插入各种合 适的突变DNA片段， 用以取代目标基因 中特定DNA片段。
1. DNaseI产生随机片段；
2. 随机片段变性；
3. 随机片段复性；
4. 延伸
反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
体外随机重组法(RPR)
体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模 板，配合一套随机序列引物，先产生大量互 补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的 错配和错误引发，这些短DNA片断中也会有少 量的点突变。在随后的PCR反应中，它们互为 引物，合成出较长的片断，最终组装成完整 的基因长度，形成基因多样性文库。
通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可 以生物合成C端带有硫酯键或N端带有半胱氨酸的蛋白 质分子。两种蛋白混合后，硫酯键和半胱氨酸发生自 发连接反应，形成肽键，从而将两种蛋白连接起来。
全新蛋白质设计
指基于对蛋白质折叠规律的认识，从 氨基酸的序列出发，设计制造自然界种 不存在的全新蛋白质，使之具有特定的 空间结构和预期的功能。
Random Chimeragenesis on Transient Templates (RACHITT)
渐增切割法产生杂合酶
Incremental Truncation for Creation of Hybrid Enzyme, ITCHE 用核酸外切酶III分别消化两个非高度同 源的靶基因，控制切割速度不大于10bp/min， 每隔很短时间连续取样，迅速终止样品反应， 以获得一组一次有几个甚至一个bp缺失的片断， 然后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生 杂和基因文库。
蛋白质的定向进化
蛋白质分子定向进化的原理 蛋白质分子定向进化的策略 蛋白质分子定向进化的应用
一、蛋白质分子定向进化的原理
所谓蛋白质分子的体外定向进化，又称 实验分子进化，属于蛋白质的非理性设计， 它不需事先了解蛋白质分子的空间结构和催 化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟 自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)， 在体外随机改造蛋白质基因，并定向选择出 所需性质的突变蛋白质分子。
Directed evolution
1、突变文库的建立
易错PCR(Error Prone PCR)
采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过 调整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离 子，改变体系中四种dNTP的浓度等，改变Taq酶 的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变。 连续易错PCR是将一次PCR扩增得到的突变 基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进 行随机诱变。
DNA改组 (DNA shuffling)
DNA改组是对一组同源基因进行体外随机重 组的特殊PCR技术，又称为基因洗牌术。
用DNaseI消化不同来源的的同源DNA，接着 将这些小片断进行无引物的PCR扩增，在此过程 中，随机片断之间互为模板和引物进行扩增， 直到获得全长基因，形成突变文库。
融合表达
将2个或多个不同 的模块连接成一 个大分子，起连 接作用的氨基酸 片断为融合蛋白 接头（linker）。
如：(GGGGS)3
内含肽介导的蛋白质连接
Intein是一个自我拼接的蛋白质元件，类似于基 因组中的内含子intron在RNA的剪接中所起的重要作 用。Intein如同一个插入前体蛋白的肽段，进行自 我切除，并用一个肽键将两端的蛋白（extein）连 接起来。
Hale Waihona Puke Baidu
定向进化 = 非理性改造+ 筛选
前者是人为引发的，后者虽相当于环 境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的 作用，整个进化过程完全是在人为控制下 进行的。
二、蛋白质分子定向进化的策略
定向进化是由一个靶基因或一群相关 的家族基因起始创建分子多样性(突变和/ 或重组)文库，然后对该多样性文库的基 因产物进行筛选，那些编码改进功能产物 的基因被利用来继续下一轮进化；重复这 个过程直到达到目标。
理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜 力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定 向进化的基本先决条件。 体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工 程学的研究和应用范围，特别是能够解决合 理设计所不能解决的问题，为蛋白质分子的 结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且在 工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。
2、突变文库的筛选
表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和生
存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活 性的筛选方法，主要依据强发色体底物(颜色变化)、易观 察的克隆表现(溶解圈)或荧光产物来筛选突变体。
高通量筛选蛋白质突变体库的方法：
如表面展示技术。
噬菌体表面展示技术
Phage display techniques
交错延伸法(StEP)
交错延伸(staggered extension process, StEP)是一种简化的DNA改组技术，它是在PCR 反应中，将含不同点突变的模板混合，随之进 行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮 中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含 不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而 实现不同模板间的重组，如此重复直至获得全 长基因片段，结果产生相间的含不同模板序列 的新生DNA分子。
不依赖于DNA序列 同源性
无活性重组
不依赖同源序列的蛋白质重组
（sequence homology independent protein recombination, SHIPRE）
将2个靶基因串联在同一载体上；PCR 将α–硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物 中；用核酸外切酶III处理产生不同截短程 度的DNA片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基 因长度相似的随机片断，与表达载体连接 重组，形成杂合文库。