农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导的T-DNA转化法简介
农杆菌介导的T-DNA转化法简介
农杆菌介导的T-DNA转化法是一种在植物遗传学中常用的技术，利用农杆菌的Ti质粒将特定的DNA片段（T-DNA）转移到植物基因组中，从而实现对植物基因的敲除或功能修改。
T-DNA的整合机制
T-DNA的整合过程通常是随机的，通过非同源末端连接（NHEJ）或微同源介导的末端连接（MMEJ）等DNA修复机制完成。
这种整合可以导致植物基因的表达失活或改变。
敲除植物基因的步骤
1.选择植物材料：选择易于农杆菌转化的植物品种。
2.构建转化载体：将目标基因序列插入T-DNA载体中。
3.农杆菌转化：将载体转化到农杆菌中。
4.植物转化：利用农杆菌感染植物细胞。
5.筛选转化植物：使用选择标记筛选转化的植物。
6.验证转化植物：通过分子生物学方法验证T-DNA整合。
7.表型分析：分析基因敲除的表型效果。
敲除基因的应用意义
敲除特定的植物基因可以帮助科学家研究基因的功能和调控网络，对于理解植物生长发育、病害防治等方面具有重要意义。
实验室操作的注意事项
在进行农杆菌介导的T-DNA转化实验时，需要注意选择合适的植物材料、构建高效的转化载体、严格的筛选过程以及准确的分子验证方法。
同时，确保遵循相关的生物安全规定和指南。
农杆菌介导法
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁 香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食 子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基 苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。 双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子， 而使T- DNA可以成功的转入； 而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区 的基因，达到转基因的目的。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP 1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。 1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
VirD
4.5
4
16,47,21,75
C/M?
T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein? nuclear localization?(VirD2)
VirC
2.0
2
26,23
C?
processing of T-DNA(VirC1)
最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接 受环境中的信号分子。 在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状 态，进而激活vir区其他基因表达。 其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为 松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使 单链T-DNA得以释放。 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的 核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。 T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终 整合进入植物核基因组。 T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表 达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
农杆菌介导转化法
它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成 肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的 遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非 必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获 得稳定的表达。
T-DNA区含选择标记基因＋报告基因
农杆菌介导转化法
转基因植物
一、植物转基因技术
• 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。 它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、 媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得
到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类
所需要的新品种或新物种。
目的基因的分离和克隆 克隆基因的鉴定与分析
报告基因 选择标记基因
遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因（npt－Ⅱ，hpt）确定选择用抗生素类型，报告基
因（gfp,gus)可以通过快速鉴定，迅速确定材料是否能够表达外源报 告基因，及其统计转化效率，获得最佳诱导因素的梯度，从而优化 目的基因的转化条件，之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应；gfp基因产物 直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。
待改良植物的预处理 受体细胞系统建立
目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化 目的基因在受体细胞的整合与表达 转化细胞克隆的筛选 转基因植株的获得与分子鉴定
田间性状鉴定
育成转基因植物新品种
二、植物基因转化方法
（一）外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法（双、单子叶植物） （二）外源基因的直接转化法 物理法诱导DNA直接转化： 基因枪法(单子叶植物 )、显微注射 化学诱导DNA直接转化： PEG(原生质体） （三）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
农杆菌介导的转化方法
第二步 感染植物
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的 基部）。
第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB… 第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
① Ti质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双子 叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
根瘤
改造后的Ti质粒载体模式
ori
4
② 农杆菌的感染和生存 第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香 酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的 毒性基因表达。
农杆菌介导转化法
农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含 有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以 转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增 加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活-integration method
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染
愈伤组织 分化生芽
生根
3. 活 体 接 种 法
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法是一种利用外源DNA和农杆菌介导的在细胞内表达的方法。
该方法最早由美国生物化学家Herbert Boyer于1973年提出，并于1977年被用于创造第一个基因突变植物。
自此，农杆菌转化技术在分子生物学、分子遗传学、细胞生物学等领域取得了巨大成功，成为近十几年来生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化法的原理是将外源DNA片段植入特定的农杆菌中，然后让农杆菌介导将外源DNA片段植入到宿主细胞中，以达到改变宿主基因的目的。
具体而言，首先需要在细胞中引入一种叫做“质粒”的载体，它可以携带外源DNA片段，然后在细胞中的特定位置，利用农杆菌提供的一些促进基因转移的酶将质粒植入细胞中。
农杆菌转化法为研究植物基因组提供了一种灵活、可靠、快速且高效的方法，可以用来改变植物的遗传特性，控制植物的生长发育状态，以及提高植物的产量和质量。
而且，农杆菌转化技术还可以用来为研究人员提供精确的模型，以更好地理解植物的基因表达和调控机制。
此外，农杆菌转化法还可以用于制造生物材料和医药，以及制造其他用途的产品。
因此，农杆菌转化法在生物技术领域具有重要的应用价值，是生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化法基本操作与理论
2021/3/27
CHENLI
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二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
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谢谢观看！
2021/3/27
CHENLI
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完
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CHENLI
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三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。
1农杆菌介导转化法081一简介农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位并诱导产生冠痪瘤或发状根
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated transformation）是一种常用的转基因技术方法，用于将外源基因导入目标植物的基因组中。
该方法利用一种土壤细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes）作为载体，将目标基因转移到植物细胞中。
农杆菌介导转化法具有高效、广谱、可逆和整合性等特点，因此被广泛应用于农业和植物基因工程研究中。
2.转化农杆菌：将农杆菌和构造体进行共转化。
这个步骤需要确保构造体能够稳定地进入到农杆菌的细胞质中，并且能够被菌体所拷贝。
一般使用电击法、化学法或冷冻法来完成这个步骤。
3.培养农杆菌：将转化后的农杆菌分别培养在选择性培养基上，以筛选出带有目标基因的菌落。
4.感染植物：通过注射或浸渍等方式将培养得到的农杆菌菌体引入植物的组织或细胞中。
农杆菌会通过分泌细菌素（也称为转化素）的方式进入植物细胞，并在转化素环境下将目标基因导入到植物基因组中。
5.再生转化植株：利用组织培养方法，将含有目标基因的植物细胞培养至完整植株。
这个步骤需要将转化素与细胞分裂激素配比得当，以促进细胞分裂和组织再生。
6.筛选转化株：利用选择标记基因识别并筛选出携带目标基因的转化株。
一般使用抗生素选择法或草酮酸合酶标记法进行筛选。
7. 鉴定转化株：对筛选出的转化株进行鉴定，确认目标基因已经整合到植物基因组中。
一般利用PCR、Southern blot或Northern blot等方法进行鉴定。
通过以上步骤，农杆菌介导转化法可以实现将外源基因导入目标植物中，从而改变植物的性状或增强植物对生物胁迫的抗性。
该方法已经广泛应用于农作物的育种研究以及植物的分子生物学研究中。
农杆菌介导转化方法
农杆菌介导转化方法农杆菌介导转化方法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物、微生物等领域。
本文将介绍农杆菌介导转化方法的原理、步骤和应用。
一、原理农杆菌介导转化方法是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入目标细胞中的一种方法。
农杆菌是一种自然界广泛存在的土壤细菌，它能将其自身的DNA转移到植物细胞中，从而导致植物发生病理性变化。
利用这一特性，科学家将目标基因插入到农杆菌的载体DNA中，通过农杆菌的感染作用，将目标基因导入到目标细胞中。
二、步骤农杆菌介导转化方法通常包括以下几个步骤：1. 农杆菌培养：首先需要将含有目标基因的农杆菌培养至适宜的生长期，以保证其感染能力。
2. 植物处理：将目标植物的组织经过表面消毒处理，然后将其切割成小片或小块，以增加接触面积。
3. 农杆菌感染：将培养好的农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
通常使用浸泡法或注射法进行感染。
4. 抗生素筛选：在感染后的组织中加入适当浓度的抗生素，以筛选转化成功的细胞。
只有携带目标基因的细胞才能够存活下来。
5. 培养和再生：将筛选出的转化细胞进行培养和再生，形成转基因植株。
三、应用农杆菌介导转化方法已成功应用于多种植物和微生物中，具有以下几个优点：1. 高效性：农杆菌介导转化方法可以在较短时间内实现大量基因转化，且转化效率较高。
2. 转基因稳定性：通过农杆菌介导转化方法获得的转基因植株通常具有较高的遗传稳定性，能够稳定地传递给下一代。
3. 广泛适用性：农杆菌介导转化方法适用于多种植物和微生物，包括农作物、果树、花卉等。
可以用于改良作物的品种、抗病性、耐逆性等性状。
4. 无需种子：与传统的植物遗传改良方法相比，农杆菌介导转化方法无需使用种子，能够直接利用植物的组织进行转化，节约了时间和资源。
5. 无需外界辅助：农杆菌介导转化方法不需要借助特殊设备或昂贵试剂，只需在实验室条件下进行即可。
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。
其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。
然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。
具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。
2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。
3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。
4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。
5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。
6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。
通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。
这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。
农杆菌介导转化法的原理
农杆菌介导转化法的原理嘿，朋友们！今天咱来唠唠农杆菌介导转化法的原理。
咱先想想啊，这农杆菌就像是个特别会找路的小机灵鬼儿。
它在自然界里晃悠的时候，能找到植物身上的伤口，然后就偷偷摸摸地钻进去啦。
这就好比你在大街上走着，突然发现了一个开着门的宝库，你不得进去瞅瞅呀！这农杆菌进去之后呢，它身上带着的一些特别的东西，咱就叫它们“转化因子”吧，这些转化因子就像是一把神奇的钥匙，可以打开植物细胞的大门，把一些新的基因给送进去。
你说神奇不神奇？就好像有人给了你一把能打开神秘宝藏的钥匙一样。
然后呢，这些新基因就在植物细胞里安了家，跟着植物一起生长、发育。
这不就相当于你在那个宝库里找到了宝贝，然后带回了家，让它成为你生活的一部分嘛。
你说这农杆菌介导转化法多有意思呀！它让植物有了新的可能，就像给植物来了一次大变身。
而且呀，这个方法还挺靠谱的呢！为啥这么说呢？你想想，大自然都认可的事儿，能不靠谱嘛！咱再深入地讲讲啊，这农杆菌就像是个勤劳的小邮差，专门负责把基因信件送到植物细胞这个大邮箱里。
它能准确地找到目标，把重要的信息传递过去。
这可比我们寄信靠谱多了吧，不用担心寄丢了或者送错地方。
农杆菌介导转化法在农业上的作用那可大了去了。
咱可以通过它让植物变得更抗病、更抗旱、长得更好呀！这就好像给植物打了一针超强的营养剂，让它们茁壮成长。
要是没有这个方法，那我们得费多大的劲儿才能让植物有这些好的变化呀！说不定得试错好多回呢。
现在有了农杆菌介导转化法，一切都变得简单多啦。
你们说，这农杆菌介导转化法是不是特别神奇，特别厉害？它就像一个隐藏在大自然里的魔法，等待着我们去发现和利用。
让我们好好感谢这个神奇的小机灵鬼农杆菌吧，是它给我们的农业带来了这么多的可能性和希望！所以呀，可别小看了这农杆菌介导转化法，它可是有着大能耐的呢！。
基因导入植物细胞的方法
基因导入植物细胞的方法
基因导入植物细胞是指将外源基因导入到植物细胞中，使其产生新的性状或改良原有性状的过程。
目前常用的基因导入方法有以下几种：
1. 农杆菌介导转化法
农杆菌介导转化法是将外源基因通过农杆菌介导转入植物细胞中，使其形成新的性状。
这种方法的优点是转化效率高、操作简便、适用范围广，但缺点是需要较长时间培养农杆菌和植物组织，且存在难以预测的杂交效应。
2. 基因枪法
基因枪法是利用高压气体或加速离子束直接将外源基因导入到植物细胞中。
这种方法的优点是转化效率高、可以用于多种植物、对植物品种无限制，但缺点是存在较高的突变率和难以控制的影响。
3. 电穿孔法
电穿孔法是利用电场将外源基因导入到植物细胞中。
这种方法的优点是简单易行、转化效率高、适用于多种植物，但缺点是对植物组织存在一定的伤害。
4. 化学转化法
化学转化法是通过化学反应将外源基因转化到植物细胞中。
这种方法的优点是操作简单、适用于多种植物，但缺点是转化效率较低、存在化学物品对植物组织的
伤害。
总的来说，以上四种方法都具有优缺点，选择合适的方法需要根据不同的实验目的、植物品种和转化效率等综合因素进行考虑和选择。
农杆菌转化法
农杆菌转化法又名农杆菌Boletus介导转化法。
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根农杆菌转化法。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour including)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。
我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
本段步骤1、获取目的基因。
用限制酶切割下目的基因。
2、基因表达载体的构建。
将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。
3、将目的基因导入受体细胞。
将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。
4、目的基因的检测与鉴定。
用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定(这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步) 几种方法进行检验(根据要求选取不同方法)。
5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。
整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为:目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。
在每一步中都涉及到很多的方法与技术。
目的载体的构建，包括目的基因的克隆，载体的酶切，连接，以及测序分析。
载体的农杆菌转化，目前有很成熟的方法，试验中应注意热激和冷激的时间。
农杆菌与植株的共培养，即为植株转化实验，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。
简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程。
简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程。
农杆菌介导法是植物基因转化的一种常用方法，它可以用来对植物的叶片中的基因进行改造，从而达到特殊的种质调节和植物改良的目的。
因此，农杆菌介导法在植物基因工程方面也被广泛应用。
本文将简要介绍农杆菌介导法在植物基因转化中的具体流程。
首先，在进行植物基因转化前，需要先确定基因转移的植物物种。
之后，选择合适的农杆菌质粒，将其与基因构建物一起转入到培养基中，扩增得到足够的农杆菌质粒。
经过离心，将质粒晶态中的质粒提取出来，并根据需要稀释到合适的浓度。
之后，进行农杆菌感受体添加，使释放的农杆菌质粒可以被农杆菌感受到。
质粒的稀释液可以直接穿透植物叶子表皮，被植物体内的细胞吸收，实现基因的转染。
接着，农杆菌介导法需要利用农杆菌来筛选需要转化的植物。
首先，将植物叶片接种到农杆菌悬液中，当植物细胞被农杆菌侵入后，就可以在植物体内转化基因了。
之后，利用选择和筛选培养基及含有抗性抗生素的培养基筛选出能够识别抗病酶基因的植物，从而筛选出被转染的植物。
最后，进行植物的遗传分析，以确定最终被转换的植物株系。
通过PCR方法检测植物转化后的基因组，将最终转化出来的植物株系与未转化的植物进行对比，从而得出植物基因转化的结果。
综上所述，农杆菌介导法是一种常用的植物基因转化技术，它将植物叶片中的基因经过转染后，可以得到想要的基因效应。
此方法简单易行，可有效解决植物基因转化的难题。
农杆菌介导转化法的概述完整版
农杆菌介导转化法的概述完整版农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是生物技术领域中常用的一种基因转化技术，它是利用植物病原细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens 或 Agrobacterium rhizogenes）在哺乳动物细胞和植物细胞之间转移DNA的过程.Ti质粒在不同的农杆菌株中具有普遍性，主要包含两个部分，一部分是右边界（RB）和左边界（LB）之间的T-DNA区域，另一部分是辅助基因的区域。
T-DNA区域是真正起作用的区域，它包含多个基因，其中最重要的是含有颠倒重复序列的两个直接重复序列（Direct Repeat，DR）以及插入块（Insert）。
在农杆菌内部，T-DNA区域通过辅助基因的编码产物，如细菌激素合成生物合成酶（enzymes），被剪切出来。
剪切后的T-DNA区域携带着颠倒重复序列的两个直接重复序列（DR），与全身黑素瘤疫斑细菌的Direct Repeat（DR）高度相似，它作为单链向外产生（unidirectional）的。
Ti质粒上还存在两个移去片段（Removal Sequences）的辅助基因，它们能够结合T-DNA的两个断点，从而使T-DNA脱离质粒。
1.选择合适的农杆菌菌株：选择具有较高转化效率且对目标植物亲和性强的农杆菌株。
2.制备适宜的载体：选择合适的Ti质粒载体，可根据需要进行修饰和改造，添加目标基因、标记基因和选择基因等。
3.构建转化质粒：将目标基因和其它所需基因与农杆菌Ti质粒进行重组，得到构建好的转化质粒。
4.培养农杆菌：将重组后的质粒转化到农杆菌中，然后利用适宜的培养基进行培养和增殖，以形成菌液。
5.感染植物细胞：将培养好的农杆菌菌液与目标植物细胞接触，通过创伤组织或利用组织培养等方式实现细菌进入植物细胞内部。
6.培养转化物：将感染的组织培养在适宜的培养基上，培养一段时间，以使转化进行进一步发展，形成完整的植株。
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农杆菌介导转化法的概述集团公司文件内部编码：（TTT-UUTT-MMYB-URTTY-ITTLTY-学年第学期2014级硕士生生物化学期末论文任课老师：开课学院：课程名称：学院：专业：学号：姓名：2015年6月20日农杆菌介导转化法的概述摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。
植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。
[1]?目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。
由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
本文对农杆菌介导转化法进行综述。
关键词：农杆菌转化方法转化效率1?关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
1.1??根癌农杆菌依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。
?原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：—DNA?region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24?kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25?bp的重复序列．其中14?bp是完全保守的，分10?bp(CAGGAATATAT)和4?bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用?，因此，尤以右边界更为重要。
位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。
这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析，在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子，分别为virA-vjrH，共包括23个基因(virA，virB1-virB11，virC1，virC2，virD1-virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH)．而胭脂碱型Ti质粒的vir 区不含vjrF和virH操纵子，它含有另一个基因tzs?，也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。
该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。
?该区段调控Ti质粒的自我复制。
?在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因．染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB．它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
1.2?发根农杆菌?发根农杆菌(Agrobacterium?rhizogenes)含有Ri质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。
其侵染植物是将其Ri质粒上的T-DNA插入到宿主植物基因组中，这一点与Ti质粒相类似。
转移机制也类似，所不同的是vir区和T-DNA区所含基因及其同源性不同。
发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上，virA的产物是一种跨膜蛋白，进一步激活virG的产物。
T-DNA区的TL区具有较高的稳定性，TR区具有与生长素合成有关的基因tmsl和tms2及农杆碱或甘露碱合成基因。
TR区可进行改造，这样Ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核，进而使T-DNA整合到植物基因组中。
2??转化过程农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。
其转化过程[6-8]如下：2.1??细菌在植物伤口处附着，使受伤的植物组织产生酚类化合物，诱导Ti质粒内vir基因的表达．?在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号，?如乙酰丁香酮（As）。
当农杆菌接受到此类信号时，其vir区基因可被诱导转录。
另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的表达。
Vir区基因的活化首先是从virA基因开始的。
VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。
VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能，?自身被磷酸化激活后，使VirG蛋白活化。
VirG?蛋白是DNA?结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域，从而成为其它vir基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH等几个基因。
virC、virD、virE参与T-DNA复合体的形成和转移．ChvE可结合一些单糖，也可直接与VirA周质区相互作用，?以加强As对Vir基因的诱导?。
2.2?vir基因表达的产物作用于T-DNA产生T-DNA链，进而转化形成T-DNA复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。
?VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程．VirD1蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA．VirD2蛋白具有特异剪切单链DNA?的内切酶活性，它可以识别T-DNA底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24?bp重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA从Ti质粒上剪切下来，称T-链。
切开T-DNA后，VirD2蛋白与T一链的5’端共价结合，避免核酸外切酶降解T一链．新的T-DNA底链以此链为模板，从右端产生的DNA缺口处以5’-3’方向进行合成。
被取代的旧链游离出来，与许多VirE2蛋白分子结合组成T-DNA复合体。
此外，VirD2作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA复合体从农杆菌进入到植物细胞核。
2.3?T-DNA整合进入植物基因组并表达产生生物学效应．?T-DNA整合进宿主细胞基因组，是转化过程中最重要也最关键的步骤。
T-DNA在寄主细胞染色体上的整合是随机的，但对转录活化区域有所偏好。
T-DNA通过与事先断裂的寄主DNA双链(DSB)发生重组来完成整合，进而进行表达。
3转化方法目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用的方法是共培养法。
利用农杆菌与植物离体组织共培养进行转化，一般需要经过严格的组织培养过程以再生植株，因而转化周期比较长。
共培养前农杆菌感染愈伤组织的方式有：①将整块愈伤组织浸泡于菌液中静置培养。
②将整块愈伤组织浸泡于菌液中摇动培养。
③将菌液加至愈伤组织上。
通常使用的是第一种方式。
?现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的方法[9]，简要介绍如下：3.1?叶盘法?选取健康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养，农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的Ti或Ri质粒进入植物细胞，使外源目的基因整合到植物基因组中。
它是双子叶植物较为常用也较为简单有效的方法。
?3.2真空渗入法?该法转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。
它是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。
?3.3?原生质体法?在原生质培养的早期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养，农杆菌的Ti或Ri就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内，T-DNA就可能整合在受体基因组上。
?此外，作为载体法，新的转基因方法有：基于Ac/Ds转座系统建立的转化载体；利用噬菌体P1Cre-lox位点的特异性重组系统；利用酵母线粒体I-Scel核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统；利用双链细菌人造染色体载体系统等，能够提高转化率或转基因位点质量。
4?研究现状关于禾谷类单子叶植物农杆菌介导的遗传转化，早期的研究多采用其幼胚来评估不同条件下被农杆菌侵染的可能性。
结果显示，T-DNA向禾本科植物中的转化没有明显障碍，但人们对整合过程的了解十分有限，同时存在相当大的争议。
在此基础上，人们利用大量实验去测试不同谷类植物的不同外植体对农杆菌侵染的反应能力，以期获得稳定的转化细胞或植株。
Grimsley等（1987）首先将玉米条纹病毒(maize?streak?virus)的cDNA通过根癌农杆菌转入玉米，转入植株表现出感染症状；Gould等（1991）用根癌农杆菌感染玉米芽尖，得到少量转基因植株；Shen等（1993）观察到农杆菌介导的gus基因转入玉米芽后β-葡糖苷酸酶的表达；Mooney等（1991）采用根癌农杆菌感染小麦胚得到转化细胞；Rainer等（1990）和Chan等（1992）通过根癌农杆菌感染未成熟胚得到少量水稻转基因植株。
以上研究工作得到的转化频率很低，且没有足够的分子和遗传证据，这些研究成果很少为大家接受并承认，却是鼓舞人心的，为单子叶植物尤其是禾谷类作物转基因研究的进一步开展奠定了基础。
1993年-1994年取得了重大突破，Chan等（1993）以水稻开花授粉后10-12天的幼胚为受体，经农杆菌感染后获得了转基因植株；Hiei等（1997）以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体，获得了较多有严格分子生物学证据的转基因植株，并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进行了详细研究，建立了比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系，为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。
从此，农杆菌介导法的转化范围扩展到了许多重要的单子叶植物，包括香蕉、玉米、大麦、小麦、甘蔗、大蒜、洋葱、高梁和黑麦（Chenget?al?1997；Ishida?et?al?1996）[10-13]。