第九章吸光光度法解读
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吸光光度法知识点
第九章吸光光度法知识点吸光光度法是基于分子对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、紫外一可见吸光光度法、红外光谱法等。
1．吸光光度法的基本原理①物质对光的选择性吸收：当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。
吸收光与透射光互为补色光(它们混合在一起可组成白光)。
分子与原子、离子一样，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。
当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收某些频率的光子的能量，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态一E基态与选择性吸收的光子能量hv的关系为Hv=E激发态一E基态分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1 eV，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20 eV，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见-紫外吸光光度法。
②吸收曲线：以波长为横坐标，以吸收光的强度为纵坐标绘制的曲线，称为吸收光谱图，也称吸收曲线。
它能清楚地描述物质对不同波长的光的吸收情况。
③光的吸收定律——朗伯一比尔定律：当一束平行单色光垂直通过一厚度为b、非散射的均匀吸光物质溶液时，吸光物质吸收光能，致使透射光强度减弱。
若用I。
表示入射光强度，I t表示透射光强度，I。
与I t之比称为透光率或透光度T，T=I。
/I t，吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A表示，A=lgT=log I。
/I t。
实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯一比尔定律，其数学表达式为A=lgT=log I。
/I t =abc式中，a为吸收系数。
溶液浓度以g·L-1为单位、液层厚度以cm 为单位时，a的单位为L·g-1·cm-1。
9吸光光度法全解
A= e bc
e ——摩尔吸光系数 单位: L· mol-1 · cm-1
摩尔吸光系数e
表示吸光物质浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的 吸光度。 e 值越大，溶液的吸光能力越强，显色反应的灵敏度越 高。 e <104 为低灵敏度; e 104～105 为中等灵敏度; e >105为高灵敏度。
9.1.2 物质对光的选择性吸收
M + h M*
M + 热
基态 激发态 E1 （E） E2
M + 荧光或磷光
单色光：具有同一波长的光。 复合光：由不同波长光组成的混合光，如日光。 互补光：白光可由两种颜色的光混合而成，这两种光称 为互补色光。 物质的颜色：对不同波长的光选择性吸收，反射光的颜 色。 溶液的颜色：吸收光的互补光色，透过光的颜色。
A
N(CH3)2
多元络合物
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物 AuCl4--罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
9.4.3 显色条件
1. 显色剂用量 适当过量
M
+
R
= MR
(被测组分) (显色剂) (有色配合物)
R过量，反应完全， MR稳定，A值稳定。
黄 橙 红
绿
青 青蓝
蓝 互补色光
白光
紫
硫酸铜溶液，吸收黄光呈现蓝色。 高锰酸钾溶液，吸收绿光呈现紫色。
互补色
吸收光
物质的颜色
黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
波长范围 ( ,nm) 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
第9章 吸光光度法(2)
M + nR = MRn OHH+
(1) 影响显色剂的平衡浓度和颜色→不能过高；
(2) 影响被测金属离子的存在状态→不能过低； (3) 影响有色化合物的组成。
例：磺基水杨酸 – Fe 3+ pH = 2 ~ 3 pH = 4 ~ 7 pH = 8 ~ 10 FeR FeR2 FeR3 紫红色 橙色 黄色
四、标准曲线的绘制
由 A=abc 或 A=εbc 可知： 吸光度A与物质的浓度成正比，以A对c作图，应得一直线， 该直线称为工作曲线.( Standard curve） 在相同条件下测的试液的吸光度， 从工作曲线上就可查到试液的浓 度, 该方法称为工作曲线法。 注意什么？
a. 标准溶液浓度必须在线性范围内，即符合A= bc
2.有机显色剂 有机显色剂分子中含有某些含不饱和键的基 团如偶氮基、对醌基和羰基等生色团（ chromophoric group）和含孤对电子的基团如氨 基 、 羟 基 和 卤 代 基 等 助 色 团 （ auxochrome group）。
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O O
C=S,－N
：
（共轭双键）πe
二、参比溶液的选择 为什么要使用参比溶液？ 目的：扣除非待测组分（吸收池和各种试剂）对光的吸收， 使测得的的吸光度真正反映待测物对光的吸收。 测定时，采用两个材质、厚度相同的比色皿进行测量，其中 一个作为参比池，装入参比溶液，调节仪器使透过参比池的吸光 度为零。则测得待测溶液的吸光度为：
A=lgI0/I=lgI参比/I试液
Co2+ Fe2+,Sn4+
c. 利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d. 用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。 e. 选择适当的波长 f. 当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加 显色剂的用量来消除干扰。 g. 采用预先分离的方法。
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
第九章吸光光度法(简)
解 已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,
c
25.0 10 6 g 50.0 10 3 L
5.00 10 （4 g L1)
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
a
A bc
0.300 2.0cm 5.00 10 4 g
L1
3.00
10 2 L.g -1.cm1
III
III 0.0006mg/mL
0.3
0.2
II
I
0.1
0.0
400
500
600
/nm
１，１０－邻二氮杂菲亚 铁溶液的吸收曲线
吸收光谱或吸收曲线
max
KMnO4溶液的吸收曲线
(cKMnO4:a<b<c<d)
KMnO4溶液
对波长525nm附近的绿 色光吸收最强，而对紫 色光吸收最弱。光吸收 程度最大处的波长叫做
实验确定 4.溶剂 5.干扰的消除
三 显色剂
1 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。 2 有机显色剂：种类繁多 （1）偶氮类显色剂：性质稳定、显色灵敏度高、选择 性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。 （2）三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
§9－4 吸光度测量条件的选择
一 选择适当的入射波长
2.由于溶液本身的原因所引起的偏离
朗伯—比尔定律是建立在 均匀、非散射的溶液这个基础 上的。如果介质不均匀，呈胶 体、乳浊、悬浮状态，则入射 光除了被吸收外，还会有反射 、散射的损失，因而实际测得 的吸光度增大，导致对朗伯— 比尔定律的偏离。
3. 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化
其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主
第九章 吸光光度法
2、溶液的酸度：
绘制A-表面活性剂用量曲线 Amax所对应的用量
第四节 吸光光度法分析条件的选择 二、测量条件的选择 1、波长λ的选择 绘制吸收曲线 Amax所对应的λmax 0.15～0.80
2、吸光度范围的控制
3、参比溶液的选择 ●参比溶液用来调节仪器的工作零点,以消除由于 吸收池和溶液中某些共存物质对光的吸收、反射 或散射所造成的误差。 如何选择参比溶液？
（1）选择性要好 （2）灵敏度要高：即κ值大 （3）对比度要大:有色物质与显色剂的最大吸收波 长的差别一般要求60nm。 （4）有色物质要稳定，组成要恒定 （5）显色反应的条件要易于控制
(二)显色反应条件的选择 1、显色剂的用量： 绘制A—显色剂用量曲线
Amax所对应的用量
绘制A—酸度曲线 Amax所对应的酸度 3、时间：绘制A—时间曲线 Amax所对应的时间 4、温度：绘制A-温度(T)曲线 5、有机溶剂和表面活性剂 绘制A-有机溶剂用量曲线 Amax所对应的用量 Amax所对应的温度
第一节 吸光光度法基本原理 三、分类 紫外—可见吸光光度法、红外光谱法等
●本章主要讨论溶液的可见吸光光度法，又称分光
光度法，其测定对象以金属离子为主。
第一节 吸光光度法基本原理 四、光的基本性质 普朗克方程：
E h h
C
h: 普朗克常量=6.63×10-34J· S
电磁波谱（或光谱） —光按照波长的长短顺序排 列成谱就是电磁波谱。 可见光—人眼可以感觉到的电磁波谱就是可见光。 其波长范围是：360～750nm。
第四节
吸光光度法分析条件的选择
一、显色反应条件的选择 (一)显色反应和显色剂
1、显色反应 — 将被测组分转变成有色化合物的 反应。显色反应分为两类，一类是氧化还原反应； 另一类是络合反应。 2、显色剂 — 能与被测组分反应使之生成有色物质 的试剂称为显色剂。分为无机显色剂和有机显色剂
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
分析化学第九章吸光光度法
3. 分光光度计及其基本部件：
光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显
（1）光源 : 钨丝灯:可见、红外 400－1000nm氢灯或 氘灯：紫外 160－350nm （2）单色器： a.滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b.棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃 棱镜:可见,石英棱镜:紫 外、可见。 c.光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉原理。
吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱 单色 单一波长的光 光 光 复合光 由不同波长的光组合而成的光
两种不同颜色的单色光按一定的强度比 光的互补 例混合得到白光，那么就称这两种单色 光为互补色光
光的互补示意图
KMnO4溶液的 吸收曲线 (cKMnO4:a<b<c <d)
分子、原子、离子具有不连续的量子化能级，仅 能吸收当照射光子的能量hv与被照射粒子的 E激 － E基 ＝（hv）n因为不同物质微粒的结构不同， 共有不同的量子化能级，其能量差也不相同,因此 对光的吸收具有选择性。若固定某一溶液的浓度 C 和液层厚度 b ，测量不同 λ下的 A ，以吸光 度 A 对吸收波长λ 作图，就得到－吸收曲线， 即吸收光谱。 初步定性分析：不同物质吸收曲线的形状与最大 吸收波长不同。 定量分析：不同 C 的同一物质在吸收峰附近的 A 随 C ↑而增大，吸收曲线是吸光光度法中选择测 定波长的主要依据。
3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下 进行。 4.溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高 显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42－在水中大 部分离 解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。
5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。
6.干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物， 正干扰；生成无色络合物，负干扰。 干扰的消除：
第九章 吸光光度法
2
§8-1 吸光光度法基本原理
比色法介绍
3
一、物质对光的选择性吸收
1．光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波 长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述： = c ； 波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子的能量： E=h=hc/ （Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J .S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光,是连续光谱。 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm 远紫外区10 - 200 nm （真空紫外区）
将Mn2＋ 氧化成紫红色的MnO4- 后，在525 nm处进行测 定。
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4.显色剂 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发 生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、 对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
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§ 8-3 显色反应及显色条件的选择
一、显色反应的选择 1.选择显色反应时，应考虑的因素 灵敏度高(ε值104~105)、选择性好、生成物稳定、显色 剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之 差：“对比度”，要求△ > 60nm。 2.配位显色反应 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生 电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。 例如:Cu2+与双硫腙配位形成的双硫腙铜在 λ=533nm 处的ε=5×104
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2. 选择合适的参比溶液
为什么需要使用参比溶液？ 调节参比的A=0，使测得的的吸光度真正反映待测物的吸光强 度。扣除待测物的吸收之外的其他所有吸收。 参比溶液的选择一般遵循以下原则： ⑴ 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其 它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水) 作参比溶液； ⑵ 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液 其它组分无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；
第9章-紫外可见吸收光谱法
第九章紫外可见吸收光谱法§9-1 概述利用紫外可见分光光度计测量物质对紫外可见光的吸收程度〔吸光度〕和紫外可见吸收光谱来确定物质的组成、含量，推测物质结构的分析方法，称为紫外可见吸收光谱法或紫外可见分光光度法〔ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-VIS〕。
它具有如下特点：〔1〕灵敏度高适于微量组分的测定，一般可测定10-6g级的物质，其摩尔吸收系数可以到达104~105数量级。
(2) 准确度较高其相对误差一般在1%~5%之。
(3) 方法简便操作容易、分析速度快。
(4) 应用广泛不仅用于无机化合物的分析，更重要的是用于有机化合物的鉴定与结构分析〔鉴定有机化合物中的官能团〕。
可对同分异构体进展鉴别。
此外，还可用于配合物的组成和稳定常数的测定。
紫外可见吸收光谱法也有一定的局限性，有些有机化合物在紫外可见光区没有吸收谱带，有的仅有较简单而宽阔的吸收光谱，更有个别的紫外可见吸收光谱大体相似。
例如，甲苯和乙苯的紫外吸收光谱根本一样。
因此，单根据紫外可见吸收光谱不能完全决定这些物质的分子结构，只有与红外吸收光谱、核磁共振波谱和质谱等方法配合起来，得出的结论才会更可靠。
§9-2 紫外可见吸收光谱法的根本原理当一束紫外可见光〔波长围200~760nm〕通过一透明的物质时，具有某种能量的光子被吸收，而另一些能量的光子那么不被吸收，光子是否被物质所吸收既决定于物质的部结构，也决定于光子的能量。
当光子的能量等于电子能级的能量差时〔即ΔE电 = h f〕，那么此能量的光子被吸收，并使电子由基态跃迁到激发态。
物质对光的吸收特征，可用吸收曲线来描述。
以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得到的A-λ曲线即为紫外可见吸收光谱〔或紫外可见吸收曲线〕。
它能更清楚地描述物质对光的吸收情况〔图9-1〕。
从图9-1中可以看出：物质在某一波长处对光的吸收最强，称为最大吸收峰，对应的波长称为最大吸收波长〔λmax〕；低于高吸收峰的峰称为次峰；吸收峰旁边的一个小的曲折称为肩峰；曲线中的低谷称为波谷其所对应的波长称为最小吸〕；在吸收曲线波长最短的一端，吸收强度相当大，但不成峰形的收波长〔λmin局部，称为末端吸收。
第九章吸光光度法
绿
蓝绿
黄绿
黄 橙
绿蓝 蓝 紫 紫红
红
4
/nm 400-450
颜色 紫
互补光 黄绿
450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
• 分子、原子、离子具有不连续的量子化能 级，当照射光子的能量hv与被照射粒子的 E激 － E基 ＝（hv）n时才能发生吸收。 • 不同物质微粒的结构不同，有不同的量子 化能级，其能量差也不同，因此物质对光 的吸收具有选择性。 • 若固定某一溶液的浓度 C 和液层厚度 b ， 测量不同 λ下的 吸光度A ，以吸光度 A 对 吸收波长λ 作图，就得到－吸收曲线，即吸 收光谱。
•白光:
是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种
色光按一定比例混合而成的。
•物质的颜色:是由于物质对不同波长的光具有选择
性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收 白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光 中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的颜色和吸 收的光颜色之间是互补关系。
光的互补性与物质的颜色
二.分光光度计的主要部件
• 1.光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,
稳定。
– 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)
– 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
• 2.单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
– 棱镜: 玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm
化学分析与仪器分析方法比较
化学分析：常量组分(>1%),相对误差 0.1%～0.2%
蓝绿
黄绿
黄 橙
绿蓝 蓝 紫 紫红
红
4
/nm 400-450
颜色 紫
互补光 黄绿
450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
• 分子、原子、离子具有不连续的量子化能 级，当照射光子的能量hv与被照射粒子的 E激 － E基 ＝（hv）n时才能发生吸收。 • 不同物质微粒的结构不同，有不同的量子 化能级，其能量差也不同，因此物质对光 的吸收具有选择性。 • 若固定某一溶液的浓度 C 和液层厚度 b ， 测量不同 λ下的 吸光度A ，以吸光度 A 对 吸收波长λ 作图，就得到－吸收曲线，即吸 收光谱。
•白光:
是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种
色光按一定比例混合而成的。
•物质的颜色:是由于物质对不同波长的光具有选择
性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收 白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光 中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的颜色和吸 收的光颜色之间是互补关系。
光的互补性与物质的颜色
二.分光光度计的主要部件
• 1.光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,
稳定。
– 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)
– 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
• 2.单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
– 棱镜: 玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm
化学分析与仪器分析方法比较
化学分析：常量组分(>1%),相对误差 0.1%～0.2%
第九章 吸光光度法解析
9.1.1 物质对光的选择性吸收
吸收曲线——以波长为横坐标，吸光度为 纵坐标作图，可得到一条物质对不同波长光吸 收情况的曲线。 吸收曲线能描述物质对不同波长光的吸收能 力。如：c一定，改变入射光波长 λ，测相应 吸光度： λ1——A1 λ2——A2 λ3——A3 λ4——A4 λ5——A5
吸收曲线是吸光光度法定量分析时选择测定 波长的依据： 1. λmax称为最大吸收波长。 2. 浓度c不同，曲线形状相同，λmax不变。 3. c不同，A不同。
9.1.3 对朗比定律的偏离
——标准曲线不成直线，尤其是高浓度。 1. 物理原因(负偏离)： 单色光不纯。 A实测<A平均 2. 化学原因(正偏离)： 介质不均匀，有胶体， I散射↑，It↓，A↑。 或离解、缔合及化学变化使 c改变。 3. 标准曲线不通过原点： 参比液选择不当; 溶液性质（悬浊液不通过0）; 比色皿有问题。 4. 标准曲线呈折线状： 标液配得不准; 测量不准。
(4) MR有色化合物组成恒定，性质稳定
例：
Fe
3
SCN Fe(SCN) 偏黄
2
Fe(SCN) 2
SCN
Fe(SCN) 3
SCN
偏红
显色剂浓度不同，会形成一系列不同 组成的络合物。
例：测某些染料，溶于丙酮，一 边测，丙酮一边挥发，则c↑，A↑， ∴比色皿需盖上盖子。
瓶号 加标液 1 1ml 2 2ml 3 3ml 4 4ml 5 5ml 6 未知液
(3) 相同操作条件
加等量试剂：盐酸羟胺、缓冲液pH=4.6 加等量显色剂：邻菲罗啉（橙红色） 摇匀
(4) 标准色列
浓度由小→大，颜色由浅→深。
未知液与标准色列比较，从管上
第九章_吸光光度法
C：影响配合物的组成 对于某些生成逐级络合物的显色反应，
酸度不同，配合物的配合比不同，颜色也不 同。
如：磺基水杨酸与Fe3+生成1︰1、 1︰2 和1︰3三种颜色不同的络合物，测定时需控 制酸度。
D：显色反应酸度的确定
固定被测组分、显色剂浓度，在不同pH值下测 定吸光度，绘制pH～A曲线，曲线平直部分对应的 pH值为测定条件。
玻璃棱镜－用于可见光范围
石英棱镜－用于紫外、可见光范围
（2）光栅
根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为 不同波长的单色光，然后使所需波长的光通过 一个很窄的狭缝照射到吸收池上。它的分辨率 比棱镜大，可用的波长范围亦较宽。
3、比色皿 • 比色皿由无色透明耐腐蚀的玻璃制成， 用于盛放比色溶液，一般为长方形，有厚度 为0.5cm、1cm、2cm、3cm几种规格。同样厚 度比色皿之间的透光率相差应小于0.5％。 • 比色皿应保持十分干净，尤其要保护它 的透光面，不要用手直接触摸。 3/4体积
实验证明：如果保持入射光波长不变，溶液对光
的吸收程度与溶液浓度、液层厚度成正比。
I0
c
I A 1g I0 abc I
b
式中：A—吸光度；
I0—入射光强度；
I—透射光强度； a—吸光系数
b—液层厚度； c—有色溶液的浓度
（2）吸光系数 b：cm；c：g/L；a：L·g-1·cm-1 b：cm； c：mol/L；a(ε)： L·mol-1·cm-1 ε：摩尔吸光系数
对于溶液浓度（ C ）一定，液层厚度（ b ） 一定的有色溶液，在不同波长下，测定该有色溶液 对光的吸收程度，即可绘制吸收曲线。
A
最大吸 收波长
吸收高峰 吸收曲线
λmax
第 09 章 吸光光度法
天津理工大学
白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还 可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。 能组成白光的两种颜色的光叫补色光。
物质的颜色与吸收光的关系： 当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种 颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示 出一定的颜色。 物质所显示的颜色是吸收光的互补色。
吸收峰和最大吸收波长max • 吸收曲线上的各个峰叫吸收峰。峰越高，表 示物质对相应波长的光的吸收程度越大。其中最 高的那个峰叫最大吸收峰，它的最高点所对应的 波长叫最大吸收波长，用λmax表示。
天津理工大学
物质的吸收曲线和最 大吸收波长的特点： 1）不同的物质，吸 收曲线的形状不同， 最大吸收波长不同。 2）对同一物质，其 浓度不同时，吸收曲 线形状和最大吸收波 长不变，只是吸收程 度要发生变化，表现 在曲线上就是曲线的 高低发生变化。
价电 子
价电 子
分子 振动
分子 振动
分子 转动
天津理工大学
§9.1 吸光光度法基本原理
9.1.1物质对光的选择性吸收
1 可见光的颜色和互补色： 在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。 平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种复 合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得 的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、 绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。
κ值可以从实验中得到。
天津理工大学
摩尔吸收系数κ的讨论
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； （2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波 长等条件一定时， κ仅与吸收物质本身的性质有关，与 待测物浓度无关； （3）同一吸收物质在不同波长下的κ值是不同的。在最 大吸收波长λmax处的摩尔吸收系数κmax表明了该吸收物质 最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能 达到的最大灵敏度。
第九章 吸光光度法 (工)
该图显示了物质对不同波长光的吸收能力。 最高吸收峰对应下的波长称之为最大吸收波长， 用λmax表示。 定性分析：据物质不同吸收曲线的形状和最大吸 收峰各不相同。 定量分析：同一物质，最大吸收峰位置不变，其 吸光度随浓度增大而增大。
12
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱
1.0 0.8 Absorbance 0.6
第九章 吸光光度法
9.1 9.2 9.3 9.4 9.5
吸光光度法的基本原理 光度计及其基本部件 显色反应及显色条件的选择 吸光度测量条件的选择 吸光光度法的应用
1
9.1 吸光光度法的基本原理
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具 有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。
一、概述： 比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种 方法。
38
722型分光光度计结构方框图
光 源
分光 系统 吸收池 检测系统
39
分光光度计的主要部件
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜:玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm 半宽度 5～10nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使
6
与物质作用
电场向量 Y
Z 磁场向量 传播方向
7
微粒性 光量子，具有能量。
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J· s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
8
波粒二象性
12
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱
1.0 0.8 Absorbance 0.6
第九章 吸光光度法
9.1 9.2 9.3 9.4 9.5
吸光光度法的基本原理 光度计及其基本部件 显色反应及显色条件的选择 吸光度测量条件的选择 吸光光度法的应用
1
9.1 吸光光度法的基本原理
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具 有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。
一、概述： 比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种 方法。
38
722型分光光度计结构方框图
光 源
分光 系统 吸收池 检测系统
39
分光光度计的主要部件
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜:玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm 半宽度 5～10nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使
6
与物质作用
电场向量 Y
Z 磁场向量 传播方向
7
微粒性 光量子，具有能量。
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J· s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
8
波粒二象性
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00:35:31
9-1 吸光光度法基本原理
▪一、物质对光的选择性吸收
10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm
x 射射 线线
紫红 外外 光光
微
无
波
线பைடு நூலகம்
电
波
可见光
00:35:31
单色光、复合光、光的互补
单色光 复合光
光的互补
单一波长的光
λ 1 λ 2
00:35:31
A 1bc 或 A 2bc
非单色光引起的对吸光定律的偏离
对吸收光谱而言，b 和 c 固定，
A Ki
A或
反映了 随波长变化的情况，
单一波长， 固定；不同波 长， 不同。因此，非单色光
将导致对吸光定律的偏离。
2 1 1 对应的 1较小
2 对应的 2较大
在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色
光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。
选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。
00:35:31
吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离
00:35:31
质点间的静电作用 质点间的缔合作用 质点间的化学反应
K （或k）
摩尔吸光系数， L ·mol –1 ·cm -1
A cb
c：g / L
Ka
吸光系数， L ·g –1 ·cm -1
A acb
c：g / 100 mL K E11c%m 比吸光系数 100mL ·g –1 ·cm -1
相互关系
00:35:31
E11c%m
10a
10
M
A E11c%mcb
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 %
吸光度 与透光率 Absorbance and transmittance
lg T Kcb A T 10A 10Kbc
A T%
T ： 透光率
1.0
T
0.5
A： 吸光度
100
A
50
0
00:35:31
单色器 吸收池 检测器 显示
I0 A lg It lg T bC
I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
It
注意
入射光 I0
比较
透射光 It
吸光光度法特点： 1）检出限低 10-5-10-6mol/L 2）灵敏度高，适于测定微量组分 3）误差2-5% 4）测定迅速、操作简单、价格便宜，应用广
泛
00:35:31
吸收曲线的讨论：
①同一种物质对不同波长光的吸光度 不同。吸光度最大处对应的波长称为最
大吸收波长λmax
②不同浓度的同一种物质，其吸收曲
线形状相似λmax不变。而对于不同物质， 它们的吸收曲线形状和λmax则不同。
③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的 依据之一。
00:35:31
1 2
A1 A2
lg lg
I01 II012 I2
1bc λ 2bc
I1 I01 10λ 1bc
I 2 I02 10λ 2bc
1 + 2
A lg I01 I02 I1 I2
lg
I01
I01 10λ1bc
I02 I02
10λ2bc
λ 1 λ 2 A 1bc 或 A 2bc
1. 比色法 2. 可见分光光度法 3. 紫外分光光度法
00:35:30
目视比色法 特点
利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 方法简便，灵敏度高
00:35:30
标准系列 未知样品
分光光度法（紫外-可见分光光度法） UV-VIS
光源 参比
样品
00:35:31
0.575
由不同波长的光组合而成的光
若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
蓝绿
绿 黄绿 黄
绿蓝
橙
00:35:31
蓝 紫 紫红
红
完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过 吸收黄色光
00:35:31
光吸收原理
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了
讨论：
④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在λmax处吸光度A 的差异最大。此特性可作作
为物质定量分析的依据。
⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要 依据。
00:35:31
定性分析与定量分析的基础
B
定性分析基础
A
A
吸光的加合性
多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具 有加合性，即
A Ai ibci b ici
i
i
i
对吸收定律偏离
A
主要原因
非单色光
C
00:35:31
吸光质点的相互作用
非单色光引起的对吸光定律的偏离
设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光质点对 两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
0
C
T = 0.0 % A=∞ T = 100.0 % A = 0.0 T = 36.8 % A = 0.434
吸光系数 Absorptivity
A Kcb
b 吸光液层的厚度，光程，cm c 吸光物质的浓度： g/L, mol/L
K 比例常数
物质的性质 入射光波长 温度
取值与浓度的单位相关
c：mol / L
第九章 吸光光度法
Spectrophotometry
9-1 吸光光度法基本原理 9-2 光度计及其基本部件 9-3 显色反应及显色条件的选择 9-4 吸光度测量条件的选择 9-5 吸光光度法的应用 9-6 紫外吸收光普法简介
00:35:30
概述
吸光光度法 是基于被测物质的分子 对光 具 有选择吸收的特性而建立的分析方法。
物质对光的选择 吸收
max (A) max (B)
定量分析基础
A
在一定的实验条 件下，物质对光 的吸收与物质的 浓度成正比。
00:35:31
增 大 C
二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律
透光率 （透射比）Transmittance
入射光 I0
透射光 It
透光率定义： T It I0
00:35:31
物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子 跃迁引起的，故又称电子光谱.
S3
E3
h S2
E2
S1
E1
S0
E0
纯 电子能态 间跃迁
S2
h
S1
A
锐线光谱 A
00:35:31
S0 分子内电子跃迁
带状光谱
▪ 吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为 横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化 可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同 波长光的吸收能力。
9-1 吸光光度法基本原理
▪一、物质对光的选择性吸收
10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm
x 射射 线线
紫红 外外 光光
微
无
波
线பைடு நூலகம்
电
波
可见光
00:35:31
单色光、复合光、光的互补
单色光 复合光
光的互补
单一波长的光
λ 1 λ 2
00:35:31
A 1bc 或 A 2bc
非单色光引起的对吸光定律的偏离
对吸收光谱而言，b 和 c 固定，
A Ki
A或
反映了 随波长变化的情况，
单一波长， 固定；不同波 长， 不同。因此，非单色光
将导致对吸光定律的偏离。
2 1 1 对应的 1较小
2 对应的 2较大
在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色
光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。
选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。
00:35:31
吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离
00:35:31
质点间的静电作用 质点间的缔合作用 质点间的化学反应
K （或k）
摩尔吸光系数， L ·mol –1 ·cm -1
A cb
c：g / L
Ka
吸光系数， L ·g –1 ·cm -1
A acb
c：g / 100 mL K E11c%m 比吸光系数 100mL ·g –1 ·cm -1
相互关系
00:35:31
E11c%m
10a
10
M
A E11c%mcb
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 %
吸光度 与透光率 Absorbance and transmittance
lg T Kcb A T 10A 10Kbc
A T%
T ： 透光率
1.0
T
0.5
A： 吸光度
100
A
50
0
00:35:31
单色器 吸收池 检测器 显示
I0 A lg It lg T bC
I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
It
注意
入射光 I0
比较
透射光 It
吸光光度法特点： 1）检出限低 10-5-10-6mol/L 2）灵敏度高，适于测定微量组分 3）误差2-5% 4）测定迅速、操作简单、价格便宜，应用广
泛
00:35:31
吸收曲线的讨论：
①同一种物质对不同波长光的吸光度 不同。吸光度最大处对应的波长称为最
大吸收波长λmax
②不同浓度的同一种物质，其吸收曲
线形状相似λmax不变。而对于不同物质， 它们的吸收曲线形状和λmax则不同。
③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的 依据之一。
00:35:31
1 2
A1 A2
lg lg
I01 II012 I2
1bc λ 2bc
I1 I01 10λ 1bc
I 2 I02 10λ 2bc
1 + 2
A lg I01 I02 I1 I2
lg
I01
I01 10λ1bc
I02 I02
10λ2bc
λ 1 λ 2 A 1bc 或 A 2bc
1. 比色法 2. 可见分光光度法 3. 紫外分光光度法
00:35:30
目视比色法 特点
利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 方法简便，灵敏度高
00:35:30
标准系列 未知样品
分光光度法（紫外-可见分光光度法） UV-VIS
光源 参比
样品
00:35:31
0.575
由不同波长的光组合而成的光
若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
蓝绿
绿 黄绿 黄
绿蓝
橙
00:35:31
蓝 紫 紫红
红
完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过 吸收黄色光
00:35:31
光吸收原理
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了
讨论：
④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在λmax处吸光度A 的差异最大。此特性可作作
为物质定量分析的依据。
⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要 依据。
00:35:31
定性分析与定量分析的基础
B
定性分析基础
A
A
吸光的加合性
多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具 有加合性，即
A Ai ibci b ici
i
i
i
对吸收定律偏离
A
主要原因
非单色光
C
00:35:31
吸光质点的相互作用
非单色光引起的对吸光定律的偏离
设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光质点对 两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
0
C
T = 0.0 % A=∞ T = 100.0 % A = 0.0 T = 36.8 % A = 0.434
吸光系数 Absorptivity
A Kcb
b 吸光液层的厚度，光程，cm c 吸光物质的浓度： g/L, mol/L
K 比例常数
物质的性质 入射光波长 温度
取值与浓度的单位相关
c：mol / L
第九章 吸光光度法
Spectrophotometry
9-1 吸光光度法基本原理 9-2 光度计及其基本部件 9-3 显色反应及显色条件的选择 9-4 吸光度测量条件的选择 9-5 吸光光度法的应用 9-6 紫外吸收光普法简介
00:35:30
概述
吸光光度法 是基于被测物质的分子 对光 具 有选择吸收的特性而建立的分析方法。
物质对光的选择 吸收
max (A) max (B)
定量分析基础
A
在一定的实验条 件下，物质对光 的吸收与物质的 浓度成正比。
00:35:31
增 大 C
二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律
透光率 （透射比）Transmittance
入射光 I0
透射光 It
透光率定义： T It I0
00:35:31
物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子 跃迁引起的，故又称电子光谱.
S3
E3
h S2
E2
S1
E1
S0
E0
纯 电子能态 间跃迁
S2
h
S1
A
锐线光谱 A
00:35:31
S0 分子内电子跃迁
带状光谱
▪ 吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为 横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化 可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同 波长光的吸收能力。