DNA甲基化和肿瘤的关系

DNA甲基化的检测方法
经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变 为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种 转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。
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6.候选抑癌基因脾酪氨酸激酶syk启动子甲 基化与乳腺癌发生和转移的关系
在细胞的信号传导途径中,酪氨酸激酶起着很重要 的作用。syk在造血细胞上广泛表达, 作为信号传导过 程中一个影响因子而被广泛研究。B 细胞抗原受体 (BcR)激活以后,依赖syk 的信号传导途径调节B 细胞 的克隆表达, 分化和凋亡。磷脂酶C(PLC)-γ 2 和磷脂 酰肌醇3 激酶(PI3-K) 是syk 的关键靶位。B 细胞内 PLC-γ 2 syk的磷酸化导致ERK 和JNK激酶活性的下降, 相反,通过syk 介导Akt 激活可致PI3-K磷酸化。国外 研究认为syk,在T 细胞分化成熟过程中也起着很重要 的作用采用。
研究发现，转染了野生型syk 的乳腺癌细胞株有 抑制乳腺癌生长和转移的作用。Okamura 等认为Syk 基因的表达是p53 依赖性的。在肿瘤生成过程中，p53 的功能丧失会导致syk 的活性下降,从而使肿瘤易于生 成和转移。Carter 等认为syk 与HER2/ neu 是一对功 能相反的抑癌/癌基因，HER2/ neu 的过度表达可诱导 血管内皮细胞的收缩，从而使肿瘤细胞易于穿过血管 屏障发生转移，而syk 可抑制HER2/ neu 的收缩血管 内皮细胞作用，从而抑制肿瘤的转移。Mahabeleshwar 等研究认为，syk通过抑制磷脂酰肌醇3 (PI-3) 激酶 的活性，从而抑制肿瘤细胞的分裂和核因子NF-κ B 调 节的尿激酶型－纤溶酶激活物(u-PA) 的激活分泌,而 u-PA 的激活分泌与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移 相关。
7. 乳腺癌Nm23-H1 转移抑制基因 Nm23-H1基因的启动子有2个 CpG 岛。DNA 甲基化抑制剂 5-Aza-CdR，使 11个乳腺癌细胞系中5个细胞系的Nm23H1 表达升高，其中3个有转移能力。 Nm23-H1表达升高的同时细胞系体外转 移能力下降。
8. hDAB2IP
（人DOC-2/DAB2 interactive protein ）
syk 也可使微管的α -微管蛋白亚基磷酸化,α -微 管蛋白亚基磷酸化有调节微管细胞骨架的功能,而微 管细胞骨架是作为信号复合物装配的基础。

RT-PCR和
MS-PCR检测了40例乳腺癌组织癌旁组织及 15 例乳腺纤维瘤组织中syk基因 mRNA 的表达及syk 基因启动子甲基化情况。syk mRNA 在乳腺正常组织 中可检测到,而在乳腺癌组织中检测率很低,两组差异 有显著意义,这表明syk mRNA 的表达缺失可能与乳腺 癌的发生有关。同时，有淋巴结转移的乳腺癌组织的 syk mRNA 的检出率显著低于无淋巴结转移组,这表明 syk mRNA 的表达缺失可能与乳腺癌的转移有关。
hDAB2IP 肿瘤抑制基因是 Ras GTPase活化家族的新
成员。 乳腺癌、前列腺癌中，hDAB2IP 甲基化率高，与表达 负相关，甲基化状态在 hDAB2IP 基因失活中起关键 作用。 5-aza-2-deoxycytidine处理 后，基因表达恢 复。 hDAB2IP 的启动子区分成m2a 和 m2b。 m2a区甲基化异常：25个乳腺癌细胞系中，有11个， 占44%。39个原发乳腺癌中有15个，占 38%； m2b区 甲基化异常：25个乳腺癌细胞系中，有12 个，占48%。 39个原发乳腺癌中有13个，占 33%。 m2b区甲基化异 常和乳腺癌淋巴结转移有关 。
PR表达阴性的原发性乳腺癌及乳腺癌细胞株,约
40%的PR基因启动子甲基化。
应用DNMT1抑制剂5-aza-Dc和雌激素作用于PR阴性
的乳腺癌细胞株MSA-MB-231, PR基因启动子部分 去甲基化且基因重新表达。
3. BRCA1基因 BRCA1 基因于1994年最早报道, 为具有遗传倾向的 乳腺癌、卵巢癌的易感基因,在乳腺癌中最主要的改变 形式为等位基因杂合型缺失和突变。目前的研究认为, 在约50%的遗传性乳腺癌中，BRCA1基因的可遗传性突变 是主要的分子机制。 散发性乳腺癌病例中,BRCA1基因突变罕见。DNA甲基 化机制可以合理地解释散发性乳腺癌的BRCA1基因转录 与翻译水平异常。应用Southern印迹和甲基化敏感特异 单链构象分析法(MS-SSCA法)分析散发性乳腺癌中BRCA1 基因启动子甲基化情况,11～24.2%的病例的BRCA1基因 启动子高度甲基化。在散发型乳腺癌中,甲基化改变是 BRCA1基因失表达的重要机制之一。
DNA 甲基化与肿瘤
一、DNA甲基化与基因表达
5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基 因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基 化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。 正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启 动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作 用主要在转录水平抑制基因表达。
ZR75-1 均未检测到启动子的高甲基化,而在原发性乳腺
癌和许多ER阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB435、MDA-MB-468、Hs578t 中,近50 %的ER启动子高甲 基化。可见,DNA甲基化在乳腺癌的ER基因失活中起着十
分重要的作用。
一系列乳腺癌细胞株中DNA甲基转移酶1
患者初诊时ER表达阴性；相当一部分的乳腺癌患 者随着肿瘤病情的进展, ER由阳性变成阴性。 基因组的改变, 在ER基因失表达中作用不大。近 来的研究认为, ER基因的甲基化异常是其失活的 主要机制。
Βιβλιοθήκη Baidu用Southern
印迹杂交及MS-PCR法研究,显示在正常
乳腺组织和ER表达阳性的肿瘤细胞株,如MCF-7、T47-D、
(DNMT1) 的
活性水平检测结果显示, ER阴性的乳腺癌细胞株和ER
阳性的比较， DNMT1的表达水平无论RNA 水平或是蛋白 水平都显著升高。ER阴性的乳腺癌DNMT1在整个细胞周
期都表达,ER阳性的细胞株则DNMT1多数出现于S 期。
2.PR 基因
PR 基因1号外显子上分布有CpG岛。该基因编码两 种同源性的蛋白质hPRa和hPRb。二者的区别在于 N-末端序列和生物活性。hPRb的转录需要ER激活, 而hPRa不必。Southern印迹杂交及MS-PCR法分析
DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因 组异常也有密切的关系
甲基化异常可能通过以下途径导致的基因不稳定:
①DNA甲基化使基因突变率升高,5-甲基胞嘧啶可自发
脱氨形成胸腺嘧啶,这一频率高于胞嘧啶转变为尿嘧啶 的频率,并常导致C →T 突变。p53、Rb、c-H-ras-1基 因中均发现该类型突变。 ②启动子甲基化使一些重要的基因渐成失活,倾向基因
二、DNA甲基化与肿瘤
以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是 基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究 中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺 失， 基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。 癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导 致癌基因激活、抑癌基因的失活。 癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿 瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异 常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。
不稳定。
③肿瘤的一个重要特征是DNA启动子局部甲基化增强的 同时,基因组总甲基化水平却低于正常细胞。 基因组 总甲基化水平低也是基因不稳定的原因之一。
三、乳腺癌中基因的甲基化
1. ER基因 ER的表达与否是乳腺癌激素治疗的
一个肿瘤标记物。
ER基因启动子和1号外显子上分布有CpG岛。
乳腺癌中ER失表达是经常性事件,约1/3的乳腺癌
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制
①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的 作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转 录因子的结合而抑制转录。 ②mCpG激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。 ③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、 H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑 制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合 物共同抑制转录。
4.上皮钙黏附蛋白( E-cadherin)
黏附分子的异常，使细胞和细胞间失去黏附作用， 在肿瘤的转移和侵润中起关键作用。
E-cadherin是一种重要的钙依赖性的黏附分子, 该蛋白在上皮细胞之间起着黏附及维持组织结构完整 性的作用。正常上皮中该蛋白在细胞边缘区呈强阳性 表达,而在大多数肿瘤中表达异常。该蛋白的表达与 肿瘤的浸润、转移呈负相关。
5.P16INK4a/CDKN2A/MTS
DNA 甲基化在抑癌基因失活中起着重要的作用。 P16INK4a 编码的蛋白是细胞周期依赖性激酶4 的抑 制物(CDKI4) ,通过Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化作用 调节细胞G1 →S 期的转化。该基因转录产物是 P16INK4a与P19ARF 两种蛋白。P16INK4a失活存在于 大多数肿瘤中,但是乳腺癌中纯合性缺失、点突变极 低，分别为1.9%和1.0%。有20%～30%的原发性乳腺 癌及乳腺癌细胞株T47-D、HMECs、ZR75-1检测到5′ 端启动子和1号外显子的甲基化情况。在40例浸润性 导管癌占30%发生P16INK4a基因甲基化，与肿瘤分级、 淋巴结转移有关。
细胞生长调节、细胞间黏附等各环节。
Cyclin D2, RAR-ß , Twist, RASSF1A, HIN-1
在乳腺原发癌及其淋巴结(25例)、骨（12例）、
脑（8例）、肺转移（10例）的配对标本中检测Cyclin
D2, RAR-ß , Twist, RASSF1A, 和HIN-1 基因的高甲基
基因的突变、缺失可以解释部分E-cadherin失表达, 但是在约50%的原发性乳腺癌和乳腺癌细胞株MDAMB-435中未检测到基因的突变、缺失,应用MS-PCR 法却发现E-cadherin基因5′端CpG的高甲基化现象, 表明E-cadherin基因启动子甲基化与该基因失活密 切相关。乳腺原位导管癌中E-cadherin启动子30% 甲基化,而转移病灶上升到60% ,提示E-cadherin基 因的甲基化情况与肿瘤的恶性程度相关。 研究显示口部鳞癌淋巴结转移细胞系的E-cadherin 的低表达和甲基化有关。
化情况。与原发癌相比，转移癌均有甲基化率高的趋 势，其中淋巴结转移癌HIN-1 的甲基化状况有显著差 异，骨、脑、肺转移癌HIN-1 和 RAR-ß 有显著差异。
9.其它基因的甲基化
14-3-3σ 基因PHME1(human mammary epithelial 1) 、RARβ 2 基因(即视黄酸受 体β 基因) 等许多关键的抑癌基因和生长因
子调节基因的研究都肯定了DNA 甲基化异常
是基因失活的重要机制。这些基因的表达蛋
白产物涵盖了诸如DNA 修复、细胞周期调节、