蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
蛋白酶活力测定实验报告
蛋白酶活力测定实验报告
实验目的：
通过测定蛋白酶的活力，了解其功能和活性。
实验原理：
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，可以将蛋白质分解为多肽和氨基酸。
蛋白酶活力是指单位时间内酶水解蛋白质的能力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
本实验使用的方法是酶促反应测定法。
首先，将待测蛋白酶与底物混合，反应一定时间后，停止反应并添加淀粉溶液产生反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定反应产物。
实验步骤：
1. 预备试剂：制备蛋白酶和底物的工作液，制备淀粉溶液和反应终止剂，制备碘化钾溶液。
2. 实验装置：准备滴定装置和试管架。
3. 设置实验条件：保持温度恒定，控制pH值。
4. 实验操作：在试管中加入待测蛋白酶和底物工作液，反应一定时间后，加入淀粉溶液和反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定。
5. 记录数据：记录滴定所需碘化钾的体积，计算出酶活力。
实验结果：
根据实验数据，计算出蛋白酶的活力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
实验讨论：
分析实验结果，比较不同条件下蛋白酶的活力差异，并讨论影响蛋白酶活力的因素。
实验结论：
通过分析实验结果，得出结论，总结蛋白酶活力与其他因素之间的关系，并提出可能的应用前景。
实验总结：
总结实验过程，评价实验结果及数据，提出改进意见，并对今后可能的研究方向进行展望。
参考文献：
列出所参考的文献。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解蛋白酶活力测定的原理；2、掌握蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；② 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③ 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④ 5%三氯醋酸（TCA）溶液。
四、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
（食品化学）实验四、蛋白酶酶活力的测定
实验四、蛋白酶酶活力的测定一、原理以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。
蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。
二、材料、仪器与试剂（一）材料：木瓜蛋白酶（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃棒。
（三）试剂：1福林试剂(Folin试剂)市场购买的Folin试剂。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍的福林试剂。
2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L 溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
3、酪蛋白溶液2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。
临用现配。
4、三氯醋酸溶液称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液5、酪氨酸标准溶液精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。
取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、20、40、60、80、100μg/mL）6、样品溶液称取木瓜蛋白酶0.100g, 置于研钵中,加入相应的缓冲液定容至50mL,得到稀释500倍的酶液（当天配制、稀释）。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
酶活性的实验报告
一、实验目的1. 了解酶活性测定的基本原理和方法。
2. 探究温度、pH值、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和激活剂对酶活性的影响。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效、专一和可调节的特性。
酶活性是指酶催化反应的能力，通常用酶活力单位（U）表示。
在一定条件下，酶活力与反应速率成正比，即反应速率越快，酶活力越高。
本实验采用比色法测定酶活性。
在酶催化反应中，底物被转化为产物，同时产生一定量的有色物质。
通过测定有色物质的吸光度，可以计算出酶活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 酶：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
- 底物：淀粉、蛋白质、脂肪等。
- 抑制剂：碘化钠、氟化钠、氯化钠等。
- 激活剂：硫酸铵、氯化钙等。
- pH缓冲液：磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
2. 实验仪器：- 紫外-可见分光光度计- 恒温水浴锅- 移液器- 试管- 试管架- 秒表四、实验方法1. 酶活力测定：- 将酶和底物混合，置于恒温水浴锅中。
- 在一定时间内，每隔一段时间取出一定体积的反应液，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。
- 根据吸光度计算酶活力。
2. 温度对酶活性的影响：- 将酶和底物混合，分别置于不同温度的水浴锅中。
- 在一定时间内，每隔一段时间取出一定体积的反应液，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。
- 分析不同温度下酶活性的变化。
3. pH值对酶活性的影响：- 将酶和底物混合，分别置于不同pH值的缓冲液中。
- 在一定时间内，每隔一段时间取出一定体积的反应液，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。
- 分析不同pH值下酶活性的变化。
4. 底物浓度对酶活性的影响：- 将酶和不同浓度的底物混合，置于恒温水浴锅中。
- 在一定时间内，每隔一段时间取出一定体积的反应液，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。
- 分析不同底物浓度下酶活性的变化。
5. 酶浓度对酶活性的影响：- 将不同浓度的酶与底物混合，置于恒温水浴锅中。
- 在一定时间内，每隔一段时间取出一定体积的反应液，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。
酶活性实验报告
酶活性实验报告实验目的：掌握测定酶活性的方法，了解影响酶活性的因素。
实验原理：酶是生物体内一类具有生物催化作用的大分子有机化合物，是生命活动中极为重要的一类物质。
酶的催化作用对于维持生命活动有着不可替代的作用。
酶活性是指酶在一定条件下的催化作用程度的大小。
酶活性是与温度、pH值、酶浓度等多种因素有关的，我们通常采用酶活性测定来研究它们之间的关系。
实验材料：1.蛋白酶酵素;2.2%鱼胆汁液;3.0.1mol/L酸性淀粉酶溶解液;4.0.1mol/L蒸馏水;5.0.1mol/L氢氧化钠;6.四分之一玻璃片。
实验过程：1.将试液2.5mL加入玻璃管中；2.将一枚四分之一的玻璃片浸泡在试管中，并在37℃恒温水浴中孵育10分钟；3.取出玻璃片并观察其表面保留的液体厚度确定其所含淀粉的量；4.将玻璃片放入蒸馏水中清洗干净；5.重复上述步骤并将试液改为酵素水解液，记录结果；6.重复上述步骤并将试液改为鱼胆汁液水解液，记录结果。
实验结果：根据实验记录，可以计算出不同试液在相同条件下对淀粉的酶解率，运用公式E=ΔA/(Δt*V)求出酶活力。
实验分析：通过此次实验可以看出，在不同的试液中酶活力的差异性较大，说明酶活性与酶的种类有关。
同时，在不同温度、pH值等条件下酶活性也会有所不同，反映在实验结果上，也就是影响实验结果的误差。
实验结论：酵素水解液的酶活力最大，鱼胆汁液水解液的次之，而0.1mol/L酸性淀粉酶溶解液的酶活力最小。
相同的温度和时间下，不同的试液酶活力差异明显，不同的试液酶活性与其所含的主要成分有关。
蛋白酶比活力实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白酶比活力的概念及测定方法。
2. 掌握利用比色法测定蛋白酶比活力的原理和操作步骤。
3. 通过实验，了解蛋白酶在不同条件下的活性变化，为实际应用提供参考。
二、实验原理蛋白酶比活力是指单位质量的蛋白质所具有的酶活性。
在实验中，通过测定蛋白酶在一定条件下对底物（如酪蛋白）的水解程度，可以计算出蛋白酶的比活力。
本实验采用比色法，通过测定底物水解产生的产物（如酪氨酸）的吸光度变化，间接反映蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白酶样品- 酪蛋白- 0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液- 0.1mol/L Folin-酚试剂- 0.4mol/L三氯乙酸- 0.05mol/L氢氧化钠溶液- 2.5mol/L硼砂缓冲溶液（pH10.5）- 680nm比色计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 移液器- 电子天平- 恒温水浴锅- 10mL具塞试管- 50mL容量瓶- 试管架四、实验步骤1. 准备实验试剂：- 配制0.1mol/L Folin-酚试剂：将钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、硫酸锂、液溴等试剂按比例混合，微火回流加热10小时，加入碳酸钠和蒸馏水，定容至1000mL。
- 配制0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
- 配制0.05mol/L氢氧化钠溶液：按GB601配制。
- 配制2.5mol/L硼砂缓冲溶液（pH10.5）：称取硼酸钠19.08g，加水溶解并定容至1000mL，称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL，取甲液500mL乙液400mL混合，用水稀释至1000mL。
2. 实验操作：- 将酪蛋白溶解于0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中，配制成2%酪蛋白溶液。
- 将蛋白酶样品用0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至适宜浓度。
- 取10mL具塞试管，加入2%酪蛋白溶液1mL，然后加入蛋白酶溶液1mL，置于37℃恒温水浴锅中反应30分钟。
蛋白酶比活力实验报告
蛋白酶比活力实验报告蛋白酶比活力实验报告引言：蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，广泛存在于生物体内。
通过测定蛋白酶的比活力，可以评估其催化反应的速率和效率。
本实验旨在通过比较不同条件下蛋白酶的活力，探究影响蛋白酶活性的因素。
实验方法：1. 实验材料准备：- 蛋白酶溶液：从动物组织中提取的蛋白酶溶液，浓度为10 mg/mL。
- 底物溶液：使用明胶作为蛋白酶的底物，浓度为1%。
- 缓冲液：pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
- 试管：用于混合反应液的透明试管。
- 恒温水浴：用于控制反应温度的设备。
2. 实验步骤：- 步骤一：在不同温度下测定蛋白酶的活力。
- 将5 mL蛋白酶溶液和5 mL底物溶液混合，并放置于恒温水浴中，分别设置不同温度条件（如25℃、37℃、50℃）。
- 在反应开始后的1分钟、2分钟、3分钟等时间点，取出一定量的反应液，立即停止反应。
- 使用布拉德福法测定反应液中未被水解的底物浓度，计算蛋白酶的比活力。
- 步骤二：在不同pH条件下测定蛋白酶的活力。
- 在不同pH值的缓冲液中，重复上述步骤一的实验操作。
- 测定不同pH条件下蛋白酶的比活力，并比较其差异。
实验结果：1. 温度对蛋白酶活力的影响：- 在25℃、37℃和50℃下进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.05 U/mg、0.1 U/mg和0.02 U/mg。
- 结果显示，蛋白酶的活力随着温度的升高而增加，但当温度过高时（如50℃），蛋白酶的活力反而下降。
2. pH值对蛋白酶活力的影响：- 在pH为7.4、8.0和9.0的缓冲液中进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.08 U/mg、0.06 U/mg和0.04 U/mg。
- 结果显示，蛋白酶的活力在中性条件下（pH 7.4）最高，而在酸性和碱性条件下，蛋白酶的活力均降低。
讨论与结论：通过本实验，我们可以得出以下结论：1. 温度对蛋白酶活力有显著影响，适宜的温度可以提高蛋白酶的催化效率，但过高的温度会导致酶的变性，从而降低活力。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。
本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。
过氧化氢溶液（3%）。
高锰酸钾溶液（002 mol/L）。
磷酸缓冲液（pH 70）。
2、实验仪器研钵。
离心机。
移液器。
分光光度计。
恒温水浴锅。
试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。
四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。
2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。
在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。
向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。
在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。
用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。
蛋白酶提取、活力测定实验总结
发酵实验总结生物技术1002 1610100311 刘小波摘要：1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。
2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。
3、实验结果：实验原理：1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。
2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。
实验材料：玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。
实验方法：蛋白酶的筛选：1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。
发酵综合实验 实验报告
目录摘要..................................... 错误!未定义书签。
1 引言 (4)2材料与方法 ............................. 错误!未定义书签。
3 结果与讨论............................. 错误!未定义书签。
4 总结................................... 错误!未定义书签。
5 心得体会............................... 错误!未定义书签。
参考文献................................. 错误!未定义书签。
蛋白酶的发酵工艺研究摘要中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。
本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响.通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。
利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。
利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3。
0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml,pH 7.2—7。
4为最适宜培养基组分。
并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。
关键词:中性蛋白酶; 枯草芽孢杆菌；摇瓶培养；发酵罐The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ，which can be used for leather hair removal，softening， animal blood protein hydrolysis， wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment。
蛋白酶酶活力的测定
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社
蛋白酶活性检测实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
2. 了解蛋白酶的特性和作用。
3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。
二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。
蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。
2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。
3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。
（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。
（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。
（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。
（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。
（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。
6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。
（2）分析蛋白酶的特性和作用。
五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。
（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。
2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。
（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。
六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
酶活力的测定实验报告
酶活力的测定实验报告酶活力的测定实验报告引言：酶是一类生物催化剂，能够加速生物体内化学反应的速率。
酶活力的测定是生物学实验中常见的实验之一，通过测定酶活力的大小，可以了解酶在不同条件下的催化效果，进而研究酶的特性及其在生物体内的作用机制。
本实验旨在通过测定过氧化氢酶的活力，探究酶活力与温度、酶浓度和底物浓度的关系。
材料与方法：1. 实验所需材料包括过氧化氢酶溶液、过氧化氢底物、缓冲液、显色剂等。
2. 实验仪器包括分光光度计、试管、移液器等。
3. 实验步骤：a. 准备一组不同温度下的试验样品，分别将过氧化氢酶溶液和过氧化氢底物按照一定比例混合，并加入适量的缓冲液。
b. 在不同温度下，将试验样品分别放入预先恒温的水浴中反应一定时间。
c. 取出反应后的试验样品，加入显色剂，并在分光光度计中测定吸光度。
d. 重复上述步骤，分别改变酶浓度和底物浓度，进行实验。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同条件下的酶活力数据，并进行了分析和讨论。
1. 温度对酶活力的影响：在实验中，我们分别将试验样品置于不同温度下进行反应，结果发现酶活力随温度的变化呈现一定的规律性。
当温度较低时，酶活力较低，随着温度的升高，酶活力逐渐增加，但当温度超过一定范围后，酶活力开始下降。
这是因为酶是一种蛋白质，其结构在高温下容易受到破坏，从而导致酶活力的降低。
2. 酶浓度对酶活力的影响：在实验中，我们分别改变了酶的浓度，结果发现酶浓度对酶活力有着明显的影响。
当酶浓度较低时，酶活力较低，随着酶浓度的增加，酶活力逐渐增加，但当酶浓度超过一定范围后，酶活力开始趋于饱和，增加酶浓度对酶活力的提高效果不明显。
这是因为酶浓度的增加会导致底物与酶结合的速率增加，但酶分子之间的竞争也会增加，从而限制了酶活力的提高。
3. 底物浓度对酶活力的影响：在实验中，我们分别改变了底物的浓度，结果发现底物浓度对酶活力也有着明显的影响。
当底物浓度较低时，酶活力较低，随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但当底物浓度超过一定范围后，酶活力开始趋于饱和，增加底物浓度对酶活力的提高效果不明显。
蛋白酶的测定
2. 蛋白酶的发酵与酶活力测定2.1 实验目的1）了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。
2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
2.2 实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵培养，每隔3h取一次样，测量它的OD值，绘制产蛋白酶芽孢杆菌生长曲线。
蛋白酶在一定的温度与pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力2.3实验仪器与实验材料：菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源：蛋白酶发酵液；培养基及试剂：牛肉膏蛋白冻液体培养基；酪素培养基、蛋白酶活力检测试剂仪器：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、试剂瓶、接种针、玻璃棒、移液枪、10ml离心管28-32个、试管4支、PH计等。
2.4 实验流程：第一天（2012年5月17日）实验内容：种子培养液与发酵培养液制备实验试剂：产蛋白酶芽孢杆菌菌种、种子培养液（不加琼脂的牛肉膏蛋白胨液体培养基）、发酵培养液（不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变）、1mol/LNaOH、1mol/LHcl 实验器材：250ml锥形瓶3个、玻璃棒、接种环、100ml烧杯3个、胶头滴管1个、封口膜、标签、摇床、电子天平、PH计、10ml移液管、离心管13支等。
实验步骤：1、按配方配制牛肉膏蛋白冻液体培养基100ml作为种子培养液，装入250ml锥形瓶中2、按配方配制发酵培养液2份，各100ml装入250ml锥形瓶中（分别记为1号、2号）3、将实验所用器具（玻璃棒、接种环、移液管、试管）及培养基（250ml，用封口膜包扎）进行高压蒸汽灭菌（0.1MPa、121℃、20min）。
4、待培养基冷却后，在超净工作台上用接种环从斜面培养基上取2环产蛋白酶芽孢杆菌，接种到种子培养基内，放到摇床上，在31℃摇床培养16h。
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。
二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。
三、试剂及仪器1．福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。
使用时用2倍体积的水稀释。
2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。
3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。
4．2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。
5．pH7.2磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。
6．标准酪氨酸溶液：准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。
7．仪器：分光光度计、试管四、操作步骤1．标准曲线绘制编号0 1 2 3 4 5 6 7 80 1 2 3 4 5 6 7 8标准酪氨酸溶液(mL)[100g/mL]水(mL) 10 9 8 7 6 5 4 3 2稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g数，即为K值。
蛋白酶
蛋白酶产生菌的筛选及酶活力的测定一、实验目的学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术二．实验原理能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
三、实验材料样品：邢台学院电教楼附近的土壤。
试剂：蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等仪器和用品：三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸，玻璃搅拌棒,培养摇床,高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四、实验步骤（一）配制所需培养基（配置完一起灭菌）按照以下配方配制所需的培养基1、牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水100ml，pH7.0~ 7.2，配制200mL2、奶粉培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水100ml，pH7.0~ 7.2，脱脂奶粉3g，配制200mL (在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶)单独灭菌112℃，30min，以防破坏蛋白质。
3、发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。
在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。
0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。
０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。
2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。
５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。
四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。
２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。
在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。
00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。
00ml５％三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。
5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。
实验二十一(10) 蛋白酶活力的测定
实验目的
掌握测定蛋白酶活力的原理和方法
学习酶活力的计算方法
蛋白酶概述
内肽酶 外肽酶 二肽酶
氨肽酶 羧肽酶
蛋 白 酶
中性蛋白酶
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产生
焙烤行业； 啤酒工业； 医药工业； 纺织工业； 皮革工业； 饲料工业；
2. 酶液的制备（已制备）
3. 活力测定 3.1 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴，5 min； 3.2 按照下表操作，进行酶催化反应；
0
待测酶液 0.4 M 三氯乙酸 2% 酪蛋白溶液 0.4 M 三氯乙酸 1 mL 2 mL 1 mL ——
1
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
2
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
40℃恒温水浴锅保温，20 min 测定680 nm处吸光值 酶活力单位定义： 40℃，最适pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的 酶量为1U。 计算公式
4 酶活力= 10 ×K× n×A680
思考题
该方法测定蛋白酶活力的误差来源主要有哪些
5. 1.398中性蛋白酶 (neutral protease) 6. 2% 酪蛋白溶液（casein solution） 7. 标准酪氨酸溶液（100 μg mL-1）
仪器
分光光度计
试管
烧杯 移液管
恒温水浴锅
离心机 漏斗
实验步骤
1. 标准曲线 （已完成） 参考标曲，求出K值,K=94. n=20 000
1.398中性蛋白酶
分子量约43kD
最适pH 7. 2- 7. 4,
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级： 1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。
当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。
作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。
微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。
本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。
关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。
有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。
与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2 国内外研究概况1.2.1 微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。
当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。
1.2.2在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。
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蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级： 1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。
当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。
作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。
微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。
本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。
关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。
有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。
与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2 国内外研究概况1.2.1 微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。
当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。
1.2.2在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。
食品加工使用的蛋白酶通常来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等。
随着社会发展和生活水平不断提高，人们对肉类的需求量日益增长的同时，对肉的品质也提出了更高要求。
微生物蛋白酶肉类嫩化剂是一种专门用于嫩化肉类的生物制剂，在适当温度下，可以断裂蛋白质中的某些肽键，提高肉的嫩度，使肉变得多汁、柔软、易于咀嚼，提高了肉的成品率、保质期和经济效益，因此十分经济且便于生产，并能取得显著效果。
面包制作过程中，面粉中含有的不溶解性谷蛋白可以通过碱性蛋白酶限制性降解来修饰。
用米曲霉蛋白酶和肽酶对面筋蛋白作有限的水解，可改善面团操作性能和机械性能，以适应不同制品的需要。
酶处理后的面团其韧性和机械强度都有所增加。
过量使用蛋白酶能减少面团的混合时间和增加面包产量。
使用细菌蛋白酶可以增加面团的延展性[4]。
1.3本实验的研究内容通过研究产蛋白酶菌来了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线，了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理，掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法和掌握一定的知识与技能。
第二章材料与设备2.1菌种产蛋白酶芽孢杆菌2.2培养基2.2.1牛肉膏蛋白胨培养基2.2.2酪素培养基2.3主要试剂材料福林试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L的三氯乙酸、0.5mol/LNaOH溶液、1mol/L 和0.1mol/L盐酸溶液、硼酸缓冲液(pH=10.5)、10g酪素溶液、100ug/mL L--酪氨酸标准溶液2.4主要仪器设备UV1000分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、吸管、离心管、枪头、摇床、培养基第三章分析测定方法3.1福林-酚试剂法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
3.2蛋白酶活力测定方法按中华人民共和国专业标准 SB/T 10317-1999：蛋白酶活力测定法[5]测定。
3.2.1标准曲线的制作管号酪氨酸标准溶液的浓度ug/ml取100ug/ml酪氨酸标准溶液的体积ml取去离子水的体积ml加0.4mol/L的碳酸钠溶液的体积ml加福尔马林的体积ml测定OD680值（A）0 0 0.0 1.0 5.00 1.00 01 10 0.1 0.9 5.00 1.00 0.0892 20 0.2 0.8 5.00 1.00 0.1793 30 0.3 0.7 5.00 1.00 0.3534 40 0.4 0.6 5.00 1.00 0.4795 50 0.5 0.5 5.00 1.00 0.518加完之后，置于40+0.2水浴中显色20min，取出，用分光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。
以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值。
计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值，K=88.28。
3.2.2酶活力数值计算：X= A×K×4/10×n式中：X——样品的酶活力，U/mL；A——样品平行试验的平均吸光度；K——吸光常数；4——反应试剂的总体积，mL；10——反应时间 10min，以 1min 计；n——稀释倍数。
所得结果表示至整数。
第四章试验方法4.1试验流程培养基的配置→活化菌种→培养取样→标准曲线绘制、生长曲线绘制和酶活测定4.2培养基的制备4.2.1牛肉膏蛋白胨培养基制备配方：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、水1000ml、pH7.0~7.2、 121℃灭菌20min。
4.2.2酪素培养基制备牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L 酪素10g/L NaCl 4-5g/L PH7.2—7.4 先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min），补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。
4.3菌种活化将筛选好的并保藏在冰箱里中的未知的产蛋白酶实验菌接种2环于150 ml液体发酵培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的250 ml三角瓶中，30-32 ℃摇瓶发酵，在摇床里30℃震荡培养16到18小时，目的在于活化菌种并得到对数期菌种。
在培养瓶中进行发酵。
4.4试剂的配制4.4.1福林-酚试剂：向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4.2H2O)、25g 钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
4.4.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
4.4.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
4.4.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0. 5mol/L4.4.5 盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0. lmol/L4.4.6磷酸缓冲液(pH=7.5 )，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na,HP0,·12H,0)6. 02 g和磷酸二氢钠(NaH,PO,·2H,0)0. 5g ，加水溶解并定容至I000mL4.4.7 l0g/L酪素溶液称取酪素 1.000g，精确至0.00 lg，用少量0.5m ol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
4.4.8 100μg/mL酪氨酸溶液：精确称取0.100g酪氨酸，逐步加入lmol/L盐酸6ml溶解后，用0.1mol盐酸定容至100mL 得1mg/ml酪氨酸溶液，取此溶液10ml，用0.1mol盐酸定容到100ml,放入4度冰箱中保存。
4.5产蛋白酶菌生长曲线的测定4.5.1获取不同培养时间发酵液4.5.1.1 2013年12月11号，星期三，整点8:00时，准时接入已经活化好的对数期菌种，用1000ul 的移液枪吸取5ml的对数期菌液加入到发酵瓶A中（液体为酪素培养基），剩下的对数期菌种菌液置于4℃冰箱种中保藏于。
并同时将A号发酵瓶放到摇床中，继续30℃震荡发酵。
在直到20:00时将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5ml接种到B号发酵瓶中。
并放在30℃的摇床中继续发酵。
4.5.1.2 2013年12月12号，星期四，在8：00时，将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5ml接种到C号发酵瓶中。
立即从A、B、C号瓶移取发酵液5ml到对应的离心管中。
A瓶取样分别对应的编号是12、13、14、15、16、17、18对应培养时间为24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h。
B瓶取样分别对应的编号是6、7、8、9、10、11对应培养时间为12h、14h、16h、18h、20h、20h完成全部取样。
C瓶取样分别对应的编号是0、1、2、3、4、5对应培养时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h。
并且全部放到4度冰箱封存。
4.5.2 吸光度值的测定将编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的离心管从冰箱里取出，用离心机在设定的转速为3500rpm,离心10min,将要测酶活力的的编号的上清液倒入另一干净的试管中。
沉淀留下。
（2）离心管中加入蒸馏水5ml轻微震荡制成悬浮液。
（3）将悬浮液加到比色皿中，测其吸光度值。
测定的OD600值填入下表。
编号对照0 1 2 3 4 5 6 7 8 发酵时0 2 4 6 8 10 12 14 16间(h)光密度0 0.182 0.347 0.452 0.678 0.906 0.913 0.965 1.319 1.546 值OD600编号9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 发酵时18 20 22 24 26 28 30 32 34 36间(h)光密度1.585 1.726 1.742 1.825 1.919 1.976 1.981 1.9702.041 2.151 值OD6004.6酶活力的测定（1）待测液的制备：选择培养时间为0、6、12、18、24、30、36h的离心管，离心之后的上清液，即为待测酶液。