溶菌酶的提取-分离纯化-产物纯度鉴定和活性测定

溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。

酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。

溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。

从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。

它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。

可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。

2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。

离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。

由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。

该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。

本实验分离溶菌酶采用732型弱酸性阳离子交换树脂。

2.2、盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶。

当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶解中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO42-和NH4+）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之失水，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

盐析是若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。

由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。

溶菌酶在32%硫酸铵盐浓度下的沉淀最多，最适宜作为盐析液浓度。

经盐析得到的沉淀为溶菌酶的粗制品。

2.3 透析脱盐将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。

保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。

透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。

透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。

本实验所用的透析袋的截留分子量为10kD。

2.4 凝胶层析凝胶层析又称分子筛过滤，是一种物理的分离纯化手段，它是依据样品中各组分间分子大小的差异设计的。

凝胶层析的填料溶胀后是具有立体网状结构的球形惰性凝胶颗粒，颗粒的表面和内部形成很多孔穴，且孔穴直径较一致。

若样品中各组分的分子大小不同，样品进入凝胶层析柱后，各个组分向凝胶颗粒的孔穴内扩散，能否进入孔穴内部取决于孔穴的大小和组分分子的大小。

比孔穴孔径大的分子不能进入孔穴内部，完全被排阻在孔穴之外，只能沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，随流动相向下流动，它们在柱内迁移的路径短，停留时间短，保留值小，所以迁移率最快，首先从柱中流出；一般可选用Sephadex G-25和Sephadex G-50型号的凝胶，对于实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离（分级分离），一般选用排阻限度略大与样品中最高分子量物质的凝胶。

凝胶层析中一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。

样品浓度和分配系数无关，故样品浓度可以提高，但样品与洗脱液的相对浓度不得超过1.5-2。

2.5 SDS-PAGESDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

SDS－PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。

SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。

测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

2.6 酶活力测定酶活力是指酶催化一定的化学反应的能力。

规定1个酶活单位（IU）是指在特定的条件下，在1分钟内能够转化1微摩尔底物的酶量或是转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。

酶活力的测定方法有终止法测定酶活力和连续法测定酶活力。

实验器材：Bio-Rad低压层析系统、Bio-Rad垂直电泳系统、低速离心机、高速冷冻离心机5810R、紫外/可见分光光度计、烧杯、移液枪、培养皿材料与试剂：市售鸡蛋、溶菌酶标准样品、蛋白质分量Marker 、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、SDS、Sephadex G-100/75/50、732/724弱酸性阳离子交换树脂、透析袋（截留分子量10kD）、蓝色葡聚糖-2000、甘氨酸、TEMED、过硫酸铵、Tris碱、硫酸铵、考马斯亮蓝、甲醇、冰醋酸、溴酚蓝操作方法：1、724树脂的处理用1mol/LHCL浸泡树脂2h, 用去离子水洗至近中性, 再用1mol/LNaOH浸泡2h, 去离子水洗至近中性用过的树脂直接用浸泡, 用去离子水洗至近中性, 再用的磷酸盐缓冲液浸泡过夜, 滤后备用。

2、溶菌酶的提取1）新鲜鸡蛋清的制备取新鲜鸡蛋清，去蛋壳取蛋清，新鲜的蛋清用pH 试纸测其pH 值应为8.0 左右。

搅拌均质15min（转速以不产生泡沫为宜）。

2）树脂吸附将蛋清冷却至5℃左右，边搅拌边加入25％处理好的724树脂，保温搅拌吸附6h。

静置分层，弃去上清，将下层树脂用与其等体积的去离子水洗涤15分钟，过滤，重复洗两次。

3）洗脱在上述树脂中加入等体积浓度为10％的硫酸铵溶液，搅拌洗脱0.5h，重复洗脱2~3次，合并洗脱液。

缓慢加入硫酸铵使盐溶液浓度达到32％，放入冰箱过夜。

第二天， 4000rpm 离心10min分离沉淀物。

4）透析将沉淀物用蒸馏水溶解，装入透析袋中，10℃水中透析过夜，除去硫酸铵，收集透析液。

5）盐析将透析液移入一容器内，用0.1mol/L的NaOH调PH至8.5~9.0，如有白色沉淀，立即离心除去然后搅拌加入3mol/L的HCl，使得PH=3.5，按盐析液的体积缓缓加入5%的固体氯化钠, 则有白色沉淀生成, 在0~10℃静置48h, 抽滤得到溶菌酶粗品。

6）丙酮沉淀：洗脱液冰浴降温到4℃，搅拌下逐滴加入预冷到-10℃的2倍体积的丙酮，放置10min，离心，收获沉淀。

3、溶菌酶的纯化1）凝胶溶胀及装柱，并用洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。

并用蓝色葡聚糖-2000检测凝胶柱装填是否均匀。

2）葡聚糖凝胶层析加入溶菌酶样品溶液0.5~1mL,以5min收集1.5mL/管的速度洗脱并收集洗脱液。

记录仪记录实时检测到的洗脱液在A280出的吸光值，直接描绘出洗脱曲线。

合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。

按硫酸铵32%的比例向蛋清液中加入硫酸铵固体。

加入适量0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液，搅拌均匀，并调pH7.0。

4、溶菌酶纯度的测定（SDS-PAGE）1）SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离胶的配制和灌制2）SDS聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶的配制和灌制聚合的浓缩胶直接灌注在分离胶上，立即在浓缩胶上插上梳子，小心避免混入气泡，将凝胶垂直放置在室温下。

3）样品处理和加样加样量通常为10~25ul/每孔，每孔德最大加样量不超过33ul 。

4）电泳江电泳装置与电源连接，调节电压为200V（如果是两块0.75mm的胶，起始电流是100mA，终止电流时60mA），电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部1cm处，然后关闭电源。

5）拨胶与染色用刮勺撬开玻璃板，将经电泳分离的蛋白质样品用考马斯亮蓝R-250染色1~2h或过夜。

6）脱色7）成像系统拍照记录实验结果8）测量并计算分子量5、溶菌酶活力的测定1）溶菌酶底物的制备：将溶壁微球菌种先接种于灭菌的固体LB培养基中活化扩培, 再接种于蒸汽灭菌的液体培养基或营养肉汤培养基中, 37℃摇床培养至菌体增殖到最大密度培养10h左右, 以培养液的透光度最小为标准, 马上将培养液离心,收集沉淀的菌体。

该菌体用灭菌的生理盐水悬浮后离心, 反复洗至无蛋白以考马斯亮蓝蛋白质显色法检测, 洗3~4次，保存待用。

2）用连续法测定溶菌酶的活力：将一定量的灭活的溶壁微球菌以pH6.2的磷酸缓冲液在研钵中研成悬浮液，在22~24℃恒温下吸4mL入比色皿中，再吸1mL溶菌酶液移入比色皿，在450nm下测定30s和5min30s时的光密度。

以平均每分钟光密度下降0.001作为一个活力单位(由于溶菌酶对溶壁微球菌菌细胞壁的降解做用导致光密度的降低) 。