脂质体在基因治疗中的应用研究及进展

脂质体在基因治疗中的应用研究及进展

摘要：脂质体作为基因载体较病毒载体具有安全性高，免疫原性小，毒性小，容易制备等优点已成功应用于很多体外及动物体内实验，但由于其转染效率低，靶向性低等缺点使其发展受到了很大限制。本文作者通过查阅大量文献回顾脂质体在基因治疗中的应用以及研究进展。得出结论为目前脂质体在基因治疗中的研究热点在于提高脂质体的转染效率，在靶细胞和靶器官达到治疗浓度才能有更好的治疗效果。

关键词：脂质体；基因；转染；靶细胞；靶器官；治疗浓度

引言：基因治疗是将外源基因导入靶细胞并使其有效表达，从而达到治疗的目的。基因治疗的关键在于将目的基因导入到靶细胞或靶器官。而基因一旦进入体内，就有可能被体循环以及胞浆中的核酸酶降解，失效。为了使目的基因在起效前保持结构和功能的完整性，需利用基因载体对其进行保护。因此，基因载体的研究、发展和应用对基因治疗的成功起到至关重要的作用。理想的基因载体应具备可保护基因，使其不被体内核酸酶降解，本身以及降解产物无毒性，无免疫原性，能高效的特异性的传递基因，在体内外均稳定，易大规模生产等条件。目前基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体两类[1]。病毒载体因其存在免疫原性、细胞毒性、潜在致瘤性等安全问题，且其容纳的目的基因较小、制作成本高，因而使用受到一定限制。非病毒载体具有免疫原性低，毒性低，可携带的较大目的基因，制备成本低等优点而被广泛应用，其中以脂质体的发展和应用最为广泛。本文将就脂质体在基因治疗中的应用及研究做一简要综述。

1．脂质体的定义以及分类脂质体是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的分子有序组合体，多表现为多层囊泡结构，每一层都为类脂双分子层，层间以及脂质体的内核为水相，而双分子膜为油相。磷脂结构上包括极性部分(称极性头部)和非极性部分(非极性尾部)。在水相中，非极性疏水尾部因疏水作用力相互聚集在一起，并同时将极性的亲水头部暴露于水相中，形成稳定的结构[2]。脂质体按性能可分为一般脂质体、热敏感脂质体、光敏感脂质体、磁性脂质体以及pH 值敏感型脂质体等。按电荷性质则可分为中性脂质体、阴离子脂质体和阳离子脂质体。

2. 脂质体体介导的基因传递机制细胞主要通过内吞的方式摄取周围的大分子物质。大分子物质先被细胞膜的某一区域所包裹，之后胞膜凹陷入胞内，芽生形成囊泡。此过程由胞膜表面的受体介导，大分子物质先与细胞表面的特异性受体结合，这些受体可集中在细胞膜上称为网格蛋白包被小窝的区域中，这一区域可形成网格蛋白包被囊泡[3]。除了受体介导的内吞机制外，Anderson[4]的研究表明细胞还存在独立的网格蛋白内吞途径，其中一个途径是通过细胞膜上的称为包膜窟的一处小凹陷对大分子物质的摄取完成，这一包膜窟自身参与细胞的信号传导以及包括胞吞在内的各类运输过程。一些药物和大分子物质通常不能穿过细胞的脂质双分子层，脂质体可将此类药物和大分子物质封装于脂质体亲水的内核中，既可通过由网格包被蛋白小窝上的受体介导的细胞内吞作用，也可通过胞膜的直接融合作用将目的物质运输入胞内[5]。因为常规的脂质体最终都将被网状内皮系统从血液清除，或者是在内吞过程中被溶酶体降解。所以人们一直在寻找能提高其运输效率和防止其降解的方法。

3.各类脂质体作为基因载体在基因治疗的研究现状普通脂质体由于其易被内皮网状系统吸收，靶向性低，易被核酸酶以及溶酶体降解，传递基因的效率低，为

了解决以上问题，很多学者研制和使用了不同的方法对脂质体进行修饰和改装，形成各种类型的脂质体。

3.1阳离子脂质体阳离子脂质体是一种带正电荷的脂质囊泡，可作为负电荷物质的传递载体，尤其适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸、核糖核酸RNA以及脱氧核糖核酸DNA等物质的传递。主要优点为无需预先封装基因，而可与基因直接结合。其介导的基因传递机制为：带正电的阳离子脂质体与带负电的基因(RNA或DNA)通过静电作用形成脂质体-基因复合物，简称脂质复合物。由于阳离子脂质体表面有剩余的正电荷，脂质复合物带正电。带正电的脂质复合物先通过静电作用吸附于带负电的细胞表面[6]，再通过直接融合或者细胞内吞作用进入细胞，脂质体复合物在细胞质中释放基因或者通过与核膜融合将基因导入核内[7]。阳离子脂质体可用于体外细胞的基因转染，例如干细胞，肿瘤细胞等。Yu 等[8]用脂质体与带有神经胶质细胞来源的神经营养因子(pGDNF)基因的质粒复合，转染人脐带血来源的CD34 阳性细胞，获得了可持续表达pGDNF的细胞，证实了干细胞基因治疗中非病毒载体脂质体的可用性。Yang 等[9]成功地将生存素siRNA 由阳离子脂质体介导转染入人肝癌SMMC-7721 细胞中，转染后细胞生存素明显下降，细胞阻滞在G2/M 期，凋亡率增加，放射敏感性增加。阳离子脂质体还可用于体内的基因传递。Lan 等[10]利用阳离子脂质体与鼠内皮素抑制基因复合成脂质体基因复合体后，腹腔注射入结肠癌腹膜播散的小鼠动物模型中，延长了小鼠生存时间，还可以抑制肿瘤细胞的扩散及减少腹水的生成。

3.2纳米脂质体基因载体在体内循环的时间越长，靶细胞或者靶器官的目的基因浓度越容易达到治疗浓度。而其体内循环时间与载体的粒径有着直接的联系，传统的脂质体与粒径大的载体进入体循环后，会受到血浆中调理素的作用，短时间内被网状内皮系统清除，影响基因的传递以及治疗效果。纳米脂质体的粒径较小，可以在一定程度上增加其在体内的循环时间，提高其基因载体的作用。张宏炜等[11]用去污剂透析法制得形态较为圆整，平均粒径为(72.73±7.14) nm 的脂质体。核糖核酸酶Ⅰ体外的降解实验以及凝胶电泳分析均表明此种脂质体对质粒DNA 有较强的保护作用。刘焕义等[12]利用阳离子脂质体和融合性脂质(二油酰磷脂酰乙醇胺，DOPE)制备成纳米脂质体，包裹pORF-CD40L后与顺铂联合应用，在体外可抑制肿瘤细胞的生长以及诱导肿瘤凋亡，瘤体注射以及静脉注射两种体内治疗均可延长荷瘤动物的生存时间，激发细胞免疫反应，抑制肿瘤的生长和转移。da Silva 等[13]在预成型的脂粒中插入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-G 蛋白受体拮抗剂(DSPE-PEG-antagonist G)形成稳定型的脂质体，这种脂质体平均粒径为130 nm，且具有靶向性，包装基因效率高(1 μmol 脂质体可封装5 nmol siRNA)，易被肺小细胞癌的细胞摄取，转染率高。

3.3热敏脂质体：热敏脂质体主要以二棕榈酰磷脂酰胆碱等热敏材料制备而成。体温正常时，热敏脂质体的膜致密，内容物不易扩散。当热敏脂质体由血液循环经过预先加热的靶器官时，局部的高温只要达到磷脂由胶晶态向液晶态相变的温度，磷脂酰基链紊乱，活动增强，使得脂质体膜结构发生变化，膜流动增强，最终通透性发生改变，脂质体内容物可大量扩散到靶器官中，形成较高的药物浓度[14-15]，达到局部靶向治疗的作用。传统的热敏型脂质体一般都是在局部加热至42~45 ℃时脂质体才会释放其内容物，David 等[16]以二棕榈酰磷脂酰胆碱和单棕榈酰磷脂酰胆碱，制备的低温度的热敏脂质体可快速爆炸式释放药物，当温度达到42 ℃时，最初20 s 可释放其内容物40%左右，而传统脂质体在此温度，30 min 内才能释放约40%的内容物。低温热敏脂质体的快速释放主要与包埋