原位杂交-经典方法-地高辛标记探针
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
原位杂交
(In situ hybridization)
一、目的
掌握核酸探针原位杂交操作技术,并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位,用于细胞生物学基础研究。
二、原理
原位杂交技术(in situ hybridization)是分子生物学和组织化学成功结合的产物,是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段,即探针,在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响,因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便;由于原位杂交不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性,并可完整地保持组织与细胞的形态,更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
三、仪器设备
烘箱,切片机,展片机,染色缸,湿盒,原位PCR仪,显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。
四、材料和试剂
1.材料:带有病原体的水生动物,如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。
2.试剂:
Davidson’s AFA固定液:
330 ml 95%乙醇
220 ml 福尔马林(37~39%甲醛水溶液)
115 ml 冰醋酸
335 ml H2O
混匀后封口,室温放置;
DIG标记与检测试剂盒(Roche公司);
TNE:50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base
10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl
1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA
ddH2O 900 ml (定容至1L)
用HCl调pH至7.4,高压灭菌,4℃保存;
0.4% 甲醛:37~39%% 甲醛 5.4 ml
ddH2O 495 ml;
蛋白酶K溶液(Pr.K,10 mg/ml):10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中(用时现配);
20×SSC:3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl
0.3 mol/L柠檬酸钠88.23 g 柠檬酸钠
ddH2O 900 ml (定容至1L)
调pH至7.0,高压灭菌,4℃保存;
2×SSC:20×SSC 100 ml
ddH2O 900 ml
0.45 µm 滤膜过滤,4℃保存;
20×Denhardt’s溶液:
0.4%牛清血蛋白0.4 g牛清血蛋白
0.4%聚蔗糖0.4 g聚蔗糖
0.4%聚乙烯吡咯烷酮0.4 g聚乙烯吡咯烷酮
ddH2O 100 ml
0.45 µm 滤膜过滤,4℃保存;
25%硫酸葡聚糖:25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O(定容至100 ml),-20℃保存;杂交液:4×SSC
50% 甲酰胺
1×Denhardt’s
5% 硫酸葡聚糖
0.5 mg/ml鲑精DNA
4℃保存;
BufferI:100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base
150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl
用HCl调pH至7.5,定容至1L,高压灭菌,4℃保存,;
BufferII:0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agent
BufferI 100 ml
低温加热溶解,4℃保存一星期;
BufferIII:100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base
100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl
50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H2O
ddH2O 990 ml(定容至1L)
用HCl调pH至9.5,0.45 µm 滤膜过滤,4℃保存;
BufferIV:10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA;
显色液(NBT/BCIP使用液):20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。
水性封片剂:甘油明胶
明胶(gelatine) 8 g
酚(phenol) 0.5 ml
甘油(glycerin) 50 ml
dH2O 48 ml
(酚可选用)
五、实验方法和步骤
1、固定
现场取感染病毒、濒死的斑节对虾,于第2、3腹节间和头胸部注射Davidson’s AFA 固定液全身固定,切取头胸部,从额剑将头胸部分成2部分,再置Davidson’s AFA固定液中固定12-24h ,转入70%乙醇中保存;或者取感染病源体的鱼类、两栖类、爬行类等的各器官,按同样方法固定。取材厚度一般5 mm。固定液的量一般不少于所固定组织体积的10倍。
2、脱水和包埋(按常规组织切片技术操作)
脱水:用不同的乙醇浓度脱水
70%乙醇2次1h/次可停留
80%乙醇2次1h/次可停留
95%乙醇2次1h/次
无水乙醇2次45min /次
透明:
1/2无水乙醇+ 1/2二甲苯1次20 min
二甲苯2次 5 min /次
1/2二甲苯+ 1/2石蜡1次30 min
透腊:3次
石蜡I 45min~1h
石蜡II 45min~1h
石蜡III 45min~1h
3、切片
①载玻片和盖玻片的准备:3% HCl + 95%乙醇浸泡30min以上,擦干备用。
硅化载玻片:将载玻片分别浸入下列溶液处理
2% APES(APES溶于丙酮中) 2min
丙酮1min
dH2O 1min
烘干备用
②切4-6 µm厚的切片于载玻片上,42℃展片过夜。
4、杂交
①烘片:将切片放入烘箱内,60℃,烘45min。
②脱蜡:
二甲苯2次10min /次
1/2无水乙醇+ 1/2二甲苯1次5min
③水化:
无水乙醇2次2~3min /次
95%乙醇2次2~3min /次
80%乙醇2次2~3min /次
70%乙醇2次2~3min /次可停留
dH2O 1次2~3min /次
③消化:1×TNE 5min
Pr.K ( 10µg/ml) 200μl/片37℃10 min (湿盒内)