【CN110229786A】一种间充质干细胞的制备方法及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910386360.2

(22)申请日 2019.05.09

(71)申请人 贵州省人民医院

地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东

路83号

(72)发明人 聂瑛洁　张湘燕　陈辉　胡荣贵　

余福勋　罗振华　叶贤伟　查艳　

许永杰　

(74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务

所(普通合伙) 11670

代理人 潘卫锋

(51)Int.Cl.

C12N 5/0775(2010.01)

A61K 35/28(2015.01)

A61P 37/02(2006.01)

(54)发明名称

一种间充质干细胞的制备方法及其应用

(57)摘要

一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步

骤：(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和

胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸

物是在无菌条件下进行的；(2)通过Ficoll -

Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；(3)在

37℃下和5％CO 2的75-cm 2烧瓶中，在补充有体积

分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和

100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM -α)

中进行培养；(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细

胞的培养基；(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白

酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca -1阳性

细胞超过96.67％。本发明大幅提高了细胞增殖

速度，为细胞提供更充足的营养，促进蛋白质的

合成，可以有效地提高和增强干细胞治疗系统性

红斑狼疮的疗效。权利要求书1页 说明书11页 附图4页CN 110229786 A 2019.09.13

C N 110229786

A

权　利　要　求　书1/1页CN 110229786 A

1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；

(2)通过Ficoll-Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；

(3)在37℃下和5％CO2的75-cm2烧瓶中，在补充有体积分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM-α)中进行培养；

(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；

(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca-1阳性细胞超过96.67％。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，进行密度梯度离心法时首先将置于离心管中的骨髓抽吸物用与所述骨髓抽吸物等体积的磷酸缓冲盐溶液进行3遍洗涤。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述离心管是采用SepMate TM离心管，安装有插件；离心是以2800-3200r/min的转速进行离心操作30-40min。

4.根据权利要求1-3所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述Ficoll-Paque 为Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的产品；所述链霉素为Sigma Chemical Co.的产品；进行胰蛋白酶消化时采用质量分数为0.25％胰蛋白酶-EDTA，为Sigma Chemical Co.的产品。

5.根据权利要求1-4所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)和(3)之间好包括分选纯化的步骤，采用CD14-和CD105+双标分选纯化。

6.根据权利要求5所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，EAG培养基的pH值为

7.2-7.4。

7.根据权利要求1-6所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，进行胰蛋白酶消化的时间为3.5-4.5分钟min。

8.一种间充质干细胞的应用，其特征在于，所述间充质干细胞根据权利要求1-7的方法制备，所述间充质干细胞在疾病的早期输注到染病个体中，用药量为2剂量，每1剂量为1×106/染病个体/输注。

9.根据权利要求8所述的间充质干细胞的应用，其特征在于，疾病的早期是指染病开始的8周时间。

2