【CN110229786A】一种间充质干细胞的制备方法及其应用【专利】
一种间充质干细胞的制备方法及其应用[发明专利]
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专利名称：一种间充质干细胞的制备方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：聂瑛洁,张湘燕,陈辉,胡荣贵,余福勋,罗振华,叶贤伟,查艳,许永杰
申请号：CN201910386360.2
申请日：20190509
公开号：CN110229786A
公开日：
20190913
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；(2)通过Ficoll‑Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；(3)在37℃下和5％CO的75‑cm烧瓶中，在补充有体积分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM‑α)中进行培养；
(4)每4‑5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca‑1阳性细胞超过96.67％。
本发明大幅提高了细胞增殖速度，为细胞提供更充足的营养，促进蛋白质的合成，可以有效地提高和增强干细胞治疗系统性红斑狼疮的疗效。
申请人：贵州省人民医院
地址：550002 贵州省贵阳市南明区中山东路83号
国籍：CN
代理机构：北京栈桥知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：潘卫锋
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一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011285097.7(22)申请日 2020.11.17(71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司地址 510000 广东省广州市国际生物岛螺旋四路一号生产区第五层502单元申请人 广州赛莱拉生物基因工程有限公司(72)发明人 陈海佳 王小燕 张占英 张梦晨 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 苏云辉(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用(57)摘要本申请属于干细胞培养技术领域。
本申请提供了一种间充质干细胞外泌体提取液的制备方法和应用。
本申请的制备方法先将间充质干细胞在完全培养基中培养，再在含有药物的基础培养基进行饥饿培养，能够得到大量的、纯度高的间充质干细胞外泌体，本申请制备得到的间充质干细胞外泌体提取液不仅具有优异的细胞增殖效果，还具有一定的抗炎和清除皮脂堆积的作用。
实验结果显示，本申请制备得到的间充质干细胞外泌体能调控炎症反应，保护受损组织，降低炎症毒性伤害并提升组织耐受性，具有明显的面部痤疮治愈作用，不会造成皮肤损伤和过敏反应。
权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 112359013 A 2021.02.12C N 112359013A1.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1:用完全培养基分别接种三批间充质干细胞培养液进行细胞融合，分别记为第一批、第二批和第三批；在第一批间充质干细胞培养液中加入含有药物溶液的基础培养基进行饥饿培养，离心，收集第一上清液；S2：在第二批间充质干细胞培养液中加入所述第一上清液进行饥饿培养，离心，收集第二上清液；S3：在第三批间充质干细胞培养液中加入所述第二上清液进行饥饿培养，离心，收集上清液得到所述间充质干细胞外泌体；所述药物溶液的溶质为3,3’-二吲哚甲烷。
一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810910349.7(22)申请日 2018.08.10(71)申请人 广东唯泰生物科技有限公司地址 528200 广东省佛山市南海区桂城夏南路61号创越时代文化创意园一座8层(72)发明人 朱建斌 江嘉豪 何美弟 陈炽峰 王进辉 于莉 (74)专利代理机构 广州新诺专利商标事务所有限公司 44100代理人 许英伟(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种制备间充质干细胞外泌体的方法，包括：清洗人脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，接种培养；传代培养；第二代脐带间充质干细胞接种培养；加入促进外泌体分泌的的细胞刺激因子；待细胞生长至90％融合度时吸出第一细胞上清液用于分离外泌体；将第一细胞上清液离心去除细胞碎片，收集第二细胞上清液；将第二细胞上清液进行第一次超滤浓缩，去除多余水分，得到第一浓缩液；将第一浓缩液进行第二次超滤浓缩，去除多余水分，得到第二浓缩液；将第二浓缩液进行第一次超速离心，取上清液进行第二次超速离心，去除上清液，沉淀为干细胞分泌的外泌体；加入生理盐水清洗，离心，去除上清液，得到外泌体沉淀。
权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 109097326 A 2018.12.28C N 109097326A1.一种制备间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：清洗人脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，采用组织贴壁法接种培养；步骤2：待原代细胞长至70％融合度时进行传代培养；选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞接种培养；步骤3：在细胞培养过程中加入促进外泌体分泌的的细胞刺激因子，促进细胞生产和外泌体分泌；步骤4：待细胞生长至90％融合度时吸出第一细胞上清液用于分离外泌体；步骤5：将所述第一细胞上清液离心去除细胞碎片，收集第二细胞上清液；步骤6：将所述第二细胞上清液进行第一次超滤浓缩，去除多余水分，得到第一浓缩液；步骤7：将所述第一浓缩液进行第二次超滤浓缩，去除多余水分，得到第二浓缩液；步骤8：将所述第二浓缩液进行第一次超速离心，去除细小细胞碎片；步骤9：取上清液进行第二次超速离心，去除上清液，沉淀为干细胞分泌的外泌体；步骤10：加入生理盐水清洗，离心，去除上清液，得到外泌体沉淀。
一种适用于人脐带间充质干细胞的制备方法及应用[发明专利]
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专利名称：一种适用于人脐带间充质干细胞的制备方法及应用专利类型：发明专利
发明人：王廷华
申请号：CN201611037484.2
申请日：20161123
公开号：CN106591226A
公开日：
20170426
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种适用于人脐带间充质干细胞的制备方法及应用，采用足月剂宫产健康胎儿脐带经过无菌处理，机械剪切，经过胶原酶消化后分离培养而成，第3代左右，细胞形态变平坦，宽大，生长良好；本方法可将细胞培养至15代，细胞分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡，细胞老化，增殖明显变慢。
因此，3代细胞具有较好活力，可用于后续研究或者治疗。
本发明制备得到的适用于人脐带间充质干细胞，可以用于脑损伤治疗，提高脑损伤后的功能恢复。
申请人：昆明医科大学
地址：650031 云南省昆明市呈贡区雨花街道春融西路1168号
国籍：CN
代理机构：北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李宏伟
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一种间充质干细胞外泌体的制备方法及装置[发明专利]
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专利名称：一种间充质干细胞外泌体的制备方法及装置专利类型：发明专利
发明人：梅建勋,欧阳建华,汪凯,何伟贤
申请号：CN202111671565.9
申请日：20211231
公开号：CN114317266A
公开日：
20220412
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法及装置，使用间充质干细胞外泌体的制备装置配合完成，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：1)取明胶水溶液，用双乳法制得明胶微球粗品；将明胶微球粗品以无水乙醇脱水后，于含京尼平的无水乙醇溶液中进行交联，制得明胶微载体；2)取含明胶微载体的培养液置于箱体内部，将培养液中接种间充质干细胞，使用间充质干细胞外泌体的制备装置进行搅拌培养，待贴附于所述明胶微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，此间充质干细胞外泌体的制备装置能够保证箱体内部的湿度、温度和二氧化碳浓度，避免影响培养效果，结构简单，实用性强。
申请人：广东美赛尔细胞生物科技有限公司
地址：528051 广东省佛山市禅城区张槎一路117号二座自编3号楼一层之三
国籍：CN
代理机构：广州市红荔专利代理有限公司
代理人：李彦孚
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一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610877381.0(22)申请日 2016.09.30(71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司地址 510000 广东省广州市开发区广州国际生物岛螺旋四路一号生产区第五层502单元(72)发明人 陈海佳 葛啸虎 王一飞 李丽娟 王小燕 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 赵青朵(51)Int.Cl.A61K 38/38(2006.01)A61K 35/28(2015.01)A61K 31/375(2006.01)A61K 31/715(2006.01)A61K 47/36(2006.01)A61K 47/20(2006.01)A61K 9/08(2006.01)A61P 25/16(2006.01)(54)发明名称一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
该间充质干细胞注射液包括间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、香菇多糖、二甲基亚砜和溶媒。
本发明提供的间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，能够提高纹状体多巴胺含量，可有效治疗帕金森病。
权利要求书1页 说明书8页 附图1页CN 106177918 A 2016.12.07C N 106177918A1.一种间充质干细胞注射液，其特征在于，包括间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、香菇多糖、二甲基亚砜和溶媒。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL间充质干细胞注射液中包括：间充质干细胞：(0.5～l)×108个；人血白蛋白：1～5g；低分子肝素钙：0.5g；维生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；二甲基亚砜：5～9mL；溶媒：补足。
一种快速高效体外扩增人间充质干细胞的方法及应用[发明专利]
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专利名称：一种快速高效体外扩增人间充质干细胞的方法及应用
专利类型：发明专利
发明人：肖建辉,罗熠,钟建江,余昌胤
申请号：CN202010846476.2
申请日：20200821
公开号：CN111979186A
公开日：
20201124
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种快速高效体外扩增人间充质干细胞的方法，该方法将人外周血中的免疫细胞与人间充质干细胞以1:1‑400:1的细胞数量比例进行共培养，能极显著增强人间充质干细胞的增殖能力，其体外扩增数量是常用方法的十倍以上，且扩增后的细胞仍维持干细胞的生物学特征，并有更强的自我更新能力和多向分化潜能。
来自不同年龄人群的人外周血免疫细胞对人间充质干细胞的促增殖效应无统计学差异，不受年龄限制。
受试者用自体外周血中的免疫细胞来扩增人间充质干细胞，能规避免疫排斥风险。
采用本发明扩增的细胞移植治疗疾病模型，无免疫排斥反应。
本发明有效解决了干细胞临床应用数量不足、质量欠佳、疗效受限的问题，有巨大的应用前景。
申请人：遵义医科大学附属医院
地址：563002 贵州省遵义市大连路149号
国籍：CN
代理机构：遵义浩嘉知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李雪梅
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910386360.2
(22)申请日 2019.05.09
(71)申请人 贵州省人民医院
地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东
路83号
(72)发明人 聂瑛洁 张湘燕 陈辉 胡荣贵
余福勋 罗振华 叶贤伟 查艳
许永杰
(74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务
所(普通合伙) 11670
代理人 潘卫锋
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
A61K 35/28(2015.01)
A61P 37/02(2006.01)
(54)发明名称
一种间充质干细胞的制备方法及其应用
(57)摘要
一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步
骤：(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和
胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸
物是在无菌条件下进行的；(2)通过Ficoll -
Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；(3)在
37℃下和5％CO 2的75-cm 2烧瓶中，在补充有体积
分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和
100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM -α)
中进行培养；(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细
胞的培养基；(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白
酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca -1阳性
细胞超过96.67％。
本发明大幅提高了细胞增殖
速度，为细胞提供更充足的营养，促进蛋白质的
合成，可以有效地提高和增强干细胞治疗系统性
红斑狼疮的疗效。
权利要求书1页 说明书11页 附图4页CN 110229786 A 2019.09.13
C N 110229786
A
权 利 要 求 书1/1页CN 110229786 A
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从绿色荧光蛋白转基因的小鼠的股骨和胫骨收集等分的骨髓(BM)抽吸物，骨髓(BM)抽吸物是在无菌条件下进行的；
(2)通过Ficoll-Paque密度梯度离心法选择骨髓单核细胞；
(3)在37℃下和5％CO2的75-cm2烧瓶中，在补充有体积分数为20％胎牛血清(FBS)、100μl/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良的EAG培养基(MEM-α)中进行培养；
(4)每4-5天更换一次含有非贴壁细胞的培养基；
(5)在达到90％汇合后，通过胰蛋白酶消化收获贴壁细胞；在这种条件下，Sca-1阳性细胞超过96.67％。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，进行密度梯度离心法时首先将置于离心管中的骨髓抽吸物用与所述骨髓抽吸物等体积的磷酸缓冲盐溶液进行3遍洗涤。
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述离心管是采用SepMate TM离心管，安装有插件；离心是以2800-3200r/min的转速进行离心操作30-40min。
4.根据权利要求1-3所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述Ficoll-Paque 为Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的产品；所述链霉素为Sigma Chemical Co.的产品；进行胰蛋白酶消化时采用质量分数为0.25％胰蛋白酶-EDTA，为Sigma Chemical Co.的产品。
5.根据权利要求1-4所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)和(3)之间好包括分选纯化的步骤，采用CD14-和CD105+双标分选纯化。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，EAG培养基的pH值为
7.2-7.4。
7.根据权利要求1-6所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，进行胰蛋白酶消化的时间为3.5-4.5分钟min。
8.一种间充质干细胞的应用，其特征在于，所述间充质干细胞根据权利要求1-7的方法制备，所述间充质干细胞在疾病的早期输注到染病个体中，用药量为2剂量，每1剂量为1×106/染病个体/输注。
9.根据权利要求8所述的间充质干细胞的应用，其特征在于，疾病的早期是指染病开始的8周时间。
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