蛋白质印迹(Western blot)实验方案
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
蛋白质印迹(Western blot)样品制备
蛋白质印迹（Western blot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。
目录∙裂解缓冲液∙蛋白酶和磷酸酶抑制剂∙制备细胞培养物裂解物∙制备组织裂解物∙测定蛋白质浓度∙制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品裂解缓冲液不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS) 和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。
选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。
如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂(NP-40、Triton X-100) 的裂解缓冲液。
裂解缓冲液配方：NP-40 缓冲液∙150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40（可用Triton X-100 替代NP-40）∙50 mM Tris，pH 8.0这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。
如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）∙ 150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40 或Triton X-100∙0.5% 脱氧胆酸钠*∙0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）∙50 mM Tris，pH 8.0*可制备成10% 的母液，避光保存。
RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含NP-40 或Triton X-100 的缓冲液的效果更好。
但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。
如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
western blot 蛋白印迹法
Western blot 蛋白印迹法原理：固相载体（硝酸纤维素膜）吸附蛋白质作为抗原，相应的一抗结合上蛋白质，再与同位素或荧光标记的二抗结合，经过底物显色或放射性自显影的方法，以检测电泳分离的目的蛋白。
既可定性，也可半定量检测蛋白质。
一、提取蛋白1、细胞数107，1*PBS洗涤细胞2遍（1500rmp 5min），转移到1.5ml EP管2、冰上操作，加入裂解液50-100ul混匀。
（蛋白裂解液：蛋白酶抑制剂=100：1）3、插入冰盒30min，每10分钟震荡混匀一次4、最高速离心，移上清至新的EP管中，记录液体体积数5、取2ul 4液体至58ul的PBS中，稀释30倍，Eppendorf biophotometer plus（爱普多夫核酸蛋白测量仪）测量蛋白浓度。
6、在4中加入1/4体积的5* loading buffer，混匀后99°C水浴变性10min（使之成为线性结构，暴露抗原），放-40度保存二、配胶1、玻璃板洗净：洗衣粉—自来水—双蒸水—烘箱烤干—齐、准、正向、上架子2、配胶加入TEMED充分混合后立即灌胶（边灌边摇晃枪头液体不要加完，防止进入空气）注意事项：灌分离胶时用1ml枪吸胶沿玻璃板放出，待胶面到绿带中间线高度即可（齿梳下缘1cm）处，封胶用水要慢，避免冲破胶。
30min，水胶分界清楚后胶凝。
胶凝后滤纸吸出水层，上浓缩胶，上胶后立即上梳子，梳子平行插入，避免产生气泡。
浓缩胶凝固后，将梳子竖直向上轻轻拔出（关键步骤，齿孔齐平！！）梳子两边加少量胶液，防止第一空变形。
3、用水冲洗浓缩胶，洗去孔内碎胶，将其放入电泳槽中。
加足够电泳液后准备上样（电泳液要浸没玻璃钢，外侧加到1/3）4、根据蛋白浓度，每孔蛋白30—100ug，上样约4—7ul，将枪头入孔加样，marker3—5ul。
5、接电源，80v起，蛋白跑到分离胶以后用100v 1h或90min，一直到溴酚蓝跑出胶即可终止电泳。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
WesternBlot蛋白免疫印迹法
3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。
0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。
3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。
5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。
6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。
调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。
7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。
使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
12% 20-55
3.3
15% 10-20
2.3
18% ≤10 1.3
学湘
中 雅30％丙烯酰胺（ml）
2
2.7
3.3
4.0
5.0
6.0
心 二 1.5MTris－HCl 医 （PH8.8）（ml）
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
院 10％SDS（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
10％AP（ml）
学
学湘
中雅
心二
医
院
一：蛋白定量（实验过程）
加标样+水（共10ul）
中
儿 童 医
南 大 学
样品5ul+水5ul
加入200ul（A+B)工作液，A液：B液=50:1
学湘 中雅
混匀放置37℃培养30min,测OD值，562nm
心二
医
院标样 0
12
46
8
10
(ul)
水(ul) 10
9
8
6
4
2
0
一：蛋白定量（数据处理）
儿 童 医
南用• 在当的浓甘Tr缩氨is胶酸－中到甘：达氨在分进酸离入胶缓分后冲离，系胶由统前于由。分于离等胶速的电pH泳8现.8象，而甘被氨浓酸缩离。解这度是加由大于，
大 学
在电电泳泳迁缓移冲速液度中变主大要超存过在蛋三白种质阴－离SD子S ，复C合l离物子，、甘甘氨氨酸酸和阴C离l离子子以的及界蛋面 白很质快－超S过D蛋S 复白合质物－，SD在S浓复缩合胶物的。p这H时6.8蛋下白，质甘－氨S酸DS只复有合少物量在的分电离离胶，
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
westen blot 免疫蛋白印迹实验步骤
Western blot 实验步骤——2018.8.8一、样品及溶液准备1、匀浆器：上海净信科技有限公司线虫蛋白提取：5000条线虫加300μL western及IP裂解液（10:1加入PMSF），研磨三次，（设置：研磨45s停止30s），提取蛋白量约1500-2500mg/ml。
2、溶液①5*电泳液：Tris-base(三甲基氨基甲烷)15.1g，甘氨酸72g，SDS 5g，加水至1L，室温保存，使用时稀释10倍。
（稀释5倍，BIO-RAD电泳仪器不能维持恒压，marker很难跑全条带）。
②5*Transfer buffer ：Tris-base 15.1g，甘氨酸72g，加800mL，使用时，稀释4倍，每800mL加200mL甲醇（就是用的时候，取200mL 5X溶液，稀释成800mL，再加200mL甲醇就可以用了）。
③5* TBS buffer：NaCl 40g，KCl 1g，Tris base 15g，溶于750mL水，浓HCl 调整PH7.4，加水至1L。
使用时稀释5倍。
④TBST：500ml TBS中加入1mL Tween20⑤5%封闭液：10g脱脂奶粉加入200mLTBST。
二，电泳(一) 制胶不同蛋白质分子量适宜使用的分离胶浓度范围如下：1.0mm胶一般需要5ml分离胶溶液，1.5mm一般需要7ml分离胶溶液（加入TEMED后容易凝固，可以加大量2-3倍，以加速凝固）加入到玻璃板之间距离上缘1cm处，水封闭上层液体，达到除气泡和压胶目的。
肉眼确定水和分离胶之间出现明显的分离后，确定分离胶已完全凝结，倒掉水，并用滤纸吸掉残留在分离胶上的溶液。
将配制好的浓缩胶加到分离胶上层，加满，插入梳子。
待胶干后，保鲜膜包好（保留梳子）。
胶可提前一天制好，室温放置以便充分交联，也可现用现制。
(二）电泳1，BCA测定的蛋白浓度，并定量到同一浓度后，5*SDS loading buffer按1:5加入到样品中，100℃加热10min 蛋白变性，12000rpm离心1min 取上清。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
蛋白质印迹分析（WesternBlotAnalysis）
蛋⽩质印迹分析（WesternBlotAnalysis）蛋⽩质印迹分析(Western Blot Analysis)【实验⽬的】了解蛋⽩质印迹法的基本原理及其操作和应⽤。
【实验原理】蛋⽩质印迹法⼜称为免疫印迹法，这是⼀种可以检测固定在固相载体上蛋⽩质的免疫化学技术⽅法。
待测蛋⽩既可以是粗提物也可以经过⼀定的分离和纯化,另外这项技术的应⽤需要利⽤待测蛋⽩的单克隆或多克隆抗体进⾏识别。
如图所⽰，可溶性抗原，也就是待测蛋⽩⾸先要根据其性质，如分⼦量，分⼦⼤⼩，电荷以及其等电点等采⽤不同的电泳⽅法进⾏分离；通过电流将凝胶中的蛋⽩质转移到聚偏⼆氟⼄烯膜上；利⽤抗体（⼀抗）与抗原发⽣特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取⽬的蛋⽩。
值得注意的是在加⼊⼀抗前应⾸先加⼊⾮特异性蛋⽩，如⽜⾎清⽩蛋⽩对膜进⾏“封阻”⽽防⽌抗体与膜的⾮特异性结合。
经电泳分离后的蛋⽩往往需再利⽤电泳⽅法将蛋⽩质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常⽤的两种电转移⽅法分别为: 1.半⼲法: 凝胶和固相载体被夹在⽤缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹⼼浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进⾏。
由于湿法的使⽤弹性更⼤并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这⾥只描述湿法的基本操作过程。
对于⽬的蛋⽩的识别需要采⽤能够识别⼀抗的第⼆抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利⽤辣根过氧化物酶所催化的⼀个⽐⾊反应，该反应的产物有特定的颜⾊且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对⼆抗的识别⽽识别⼀抗，进⽽判断出⽬标蛋⽩所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验操作】⒈.蛋⽩质的分离根据⽬的蛋⽩的性质，利⽤电泳⽅法将其进⾏分离。
为提⾼电转移的效率，通常采⽤SDS/PAGE技术。
分离实验结束后，⾸先将样品墙的上边缘⽤⼩⼑去除，然后在胶板的右上⾓切⼀个⼩⼝以便定位，⼩⼼放⼊转移缓冲溶液中待⽤。
蛋白质印迹(Western blot)实验方案
蛋白质印迹（Western blot）实验方案溶液和试剂裂解缓冲液这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。
Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液150 mM NaCl1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）150 mM NaCl1.0% NP-40 或0.1% Triton X-1000.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl 缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7.5蛋白酶抑制剂电泳、转膜、封闭缓冲液Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 并调节至 pH 6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。
转膜缓冲液（半干转）48 mM Tris39 mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液中。
混匀并过滤。
过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。
实验步骤样品裂解1. 制备细胞培养物裂解物.将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
.吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
WB：WesternBlot-蛋白质印迹法
WB：WesternBlot-蛋⽩质印迹法「源」是格源致善对在个性化肿瘤疫苗研究领域内有重⼤突出贡献的⼈物或创新性的事件进⾏报道的专题。
⼀、蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
Western blot的发明者⼀般认为是美国斯坦福⼤学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。
在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析⽣物化学》（AnalyticalBiochemistry）中⾸次被称为WesternBlot。
WB的基本原理：在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测，经常⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋⽩的互作。
依其原理，可分为直接法和间接法两种⽅法，两种⽅法的⽐较如表1表1 WB直接法和间接法的⽐较⼆、WB实验步骤Western Blot的内容主要包括以下⼏个步骤：1）制样：裂解缓冲液或者超声处理。
（使⽤RIPA裂解液是需按照100:1加⼊蛋⽩酶抑制剂）2）电泳：根据蛋⽩⼤⼩确定合适的PAGE胶浓度，推荐上样量为20-30ug总蛋⽩。
3）转膜：湿转和半⼲转都可。
但在待检测蛋⽩分⼦量较⼤或低内源⽔平湿转移⽅法更佳。
4）洗膜：10min/次*3次。
5）封闭：含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h。
6）洗膜：TBST中洗涤10min。
7）孵育⼀抗：⼀抗应在含5% BSA 或5% 脱脂⽜奶的 TBST 缓冲液中稀释，参考产品说明书选择合适的⼀抗稀释⽐例。
5%推荐使⽤脱脂奶粉的TBST缓冲液，背景相对较低。
⼀抗4℃孵育过夜更好。
8）洗膜：10min/次*3次。
9）孵育⼆抗：建议在含5%脱脂⽜奶TBST中稀释⼆抗.参考⽣产商建议选择合适的⼆抗稀释⽐例。
10）洗膜：10min/次*3次。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤1. 引言嘿，大家好！今天我们要聊聊一个非常酷炫的实验——蛋白质免疫印迹实验，或者说西方印迹（Western Blot）。
听名字就很高大上对吧？其实就是用来检测特定蛋白质的。
想象一下，你在寻找一颗珍珠，蛋白质就是那颗珍珠，而免疫印迹就是我们的寻宝地图。
别担心，我会一步一步带你走过这条寻宝之路，让我们开始吧！2. 实验准备2.1 材料准备首先，准备好你的材料，这一步可马虎不得哦。
你需要的东西包括样品（这可以是细胞、组织、甚至是你那杯牛奶），裂解缓冲液、凝胶电泳设备、转膜设备、封闭液、抗体（这个可不能少！），还有洗涤液和显色试剂。
听起来有点像是做饭，其实是很简单的，像是在调配一碗美味的汤。
2.2 样品处理接下来，我们要处理样品。
把你的样品和裂解缓冲液混合，轻轻摇晃，让它们充分融合。
接着，要把这些混合液放在冰上静置一段时间，简直就是在给它们来个冷静期，让蛋白质们沉淀下来。
然后，咱们要通过离心机把细胞的碎片和其他杂质去掉。
小心别把珍珠也扔了，哈哈！3. 电泳分离3.1 凝胶制备哎呀，这时候就要准备凝胶了。
其实凝胶就像是个筛子，能让小的蛋白质通过，而大的蛋白质则被挡住。
我们一般用聚丙烯酰胺凝胶，先把它溶解，放到模具里，等它固化。
固化的时候可以去喝杯茶，顺便欣赏一下这小小的“魔法”。
3.2 电泳运行凝胶固化好后，就可以把样品上胶了。
注意哦，别搞得稀里糊涂，把样品挤到槽里。
然后把凝胶放进电泳池，接上电源，开跑！这就像在赛道上，蛋白质们各显神通，争先恐后。
别着急，等到它们跑到适当的地方，再把它们捞出来。
4. 转膜步骤4.1 转膜跑完电泳，接下来是个关键步骤——转膜。
把凝胶和膜叠在一起，放在转膜装置里，接上电源，让蛋白质们转移到膜上。
就像是把书里的内容复制到你的笔记本上，确保每个细节都不漏掉。
转膜的过程可能需要一段时间，但别担心，慢工出细活嘛！4.2 封闭和抗体孵育转完膜后，我们要进行封闭。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
蛋白免疫印迹westernblot试验
蛋白免疫印迹(western blot)实验实验步骤：一、试剂准备1.SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2.匀浆缓冲液：1.0 MTris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml； 10%SDS 6.0 ml；B -巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3.转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g； Tris 5.8 g； SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至 1000 ml。
4.0.01 M PBS(pH7.4)： NaCl 8.0 g； KCl 0.2 g； Na2HPO4 1.44 g； KH2PO4 0.24 g；加ddH2O 至 1000 ml。
5.膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml； ddH2O118 ml。
包被液(5% 脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉1.0 g溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6.显色液：DAB 6.0 mg； 0.01 M PBS 10.0 ml 硫酸镍胺 0.1 ml； H202 1.0 p l。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取(1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
(2)每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS (0.01M pH7.2〜7.3)。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10 p l PMSF (100 mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
)(4)每瓶细胞加400 p l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
(5)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
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蛋白质印迹（Western blot）实验方案
溶液和试剂
裂解缓冲液
这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。
Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液
150 mM NaCl
1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）
150 mM NaCl
1.0% NP-40 或0.1% Triton X-100
0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂
Tris-HCl 缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 7.5
蛋白酶抑制剂
电泳、转膜、封闭缓冲液
Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液
4% SDS
10% 2-巯基乙醇
20% 甘油
0.004% 溴酚蓝
0.125 M Tris-HCl
测定 pH 并调节至 pH 6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
0.1% SDS
测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
20% 甲醇
测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。
转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris
39 mM 甘氨酸
20% 甲醇
0.04% SDS
封闭缓冲液
5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）
加入 TBST 缓冲液中。
混匀并过滤。
过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。
实验步骤
样品裂解
1. 制备细胞培养物裂解物
.将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
.吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。
.用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。
.在4 ℃下持续搅拌 30 分钟。
.在4 ℃预冷的离心机中以16,000 × g 的转速离心20 分钟。
.轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。
将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。
2. 制备组织裂解物
.用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。
.将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。
将样品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。
对于约5 mg 的
组织，向离心管中快速加入约300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，
用另外300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌（例如，在回
旋振荡器上）2 小时。
. 4 ℃下在微型离心机中以16,000 × g 离心20 分钟。
轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。
将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。
弃去沉淀。
样品制备
.取出小部分(50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。
确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2× Laemmli 样品缓冲液。
我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
.还原和变性：在100 ℃下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5 分钟，并进行分装。
在-20 °C 下保存裂解物。
注意：分装细胞裂解物(50 - 100 μL)，避免反复冻融循环。
.在37 ℃下解冻装有细胞裂解物的离心管。
在微型离心机中以16,000 × g 离心5 分钟。
上样和电泳
.将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE 凝胶孔中。
来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20 - 30 μg，纯化蛋白的上样量为10 - 100 ng。
.在100 V 下电泳1 至2 小时。
膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。
用甲醇“活化”PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。
可能需要对时间和电压进行一些优化。
我们推荐按照制造商的说明进行操作。
可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。
所得膜可用于抗体染色。
抗体染色
.用5% 封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4 ℃下封闭过夜。
.用适当稀释度的一抗在 5% 或2% 封闭溶液中 4 ℃过夜孵育膜，或在室温下孵育 2 小时。
.用 TBST 洗涤膜3 次，每次 5 分钟。
.用推荐稀释度的标记二抗在含 5% 封闭缓冲液的 TBST 中室温孵育膜 1 小时。
.用 TBST 洗涤膜3 次，每次 5 分钟，然后用 TBS 冲洗。
.要产生信号，请遵循试剂盒制造商的建议。
.移除多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。
.利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
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示例上样对照：ab8227 beta actin：
所有泳道：beta Actin 抗体 - 上样对照 (ab8227)，稀释度为 1/5000
泳道 1：HeLa 全细胞提取物
泳道 2：酵母细胞提取物
泳道 3：小鼠脑组织裂解物。