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《蛋白质工程绪论》PPT演示课件
（3）pro工程与细胞工程
细胞工程是指以细胞为单位，在细胞和亚细胞 水平上有目的地进行遗传操作，通过细胞融合、核 移植等方法，培养出人们需要的新物种，克服了源 远杂交的局限性。
目前，细胞工程技术已为pro工程提供了改良 性状的微生物细胞以及稳定的动植物细胞系，以便 更好的生产pro；另外，细胞工程可通过细胞融合、 转基因技术改变生物的遗传性状或实现新型生物的 构建，进而为pro的生产提供更多良好的载体。
二、 pro工程的程序
筛选纯化需要改造的目的蛋白，研究其特性 常数等；
制备结晶，并通过aa测序、X射线晶体衍射 分析、核磁共振分析等研究，获得pro结构 与功能相关的数据；
结合生物信息学的方法对pro的改造进行分析
由aa序列及其化学结构预测pro的空间结构， 确定pro结构与功能的关系，进而从中找出可 以修饰的位点和可能的途径；
1932年，英国化学家Krebs等提出合成尿素的鸟氨 酸循环多酶反应途径。 1937年，Krebs公布了三羧酸循环的研究成果。 1940年，德国生化学家Embclen和Megerbof公布 了糖酵解途径。随后，脂肪酸氧化和核苷酸代谢途 径也相继被阐明。 同时期，我国生物化学家吴宪等提出pro变性学说。
2、pro的结构、功能设计和预测 pro分子设计按照被改造部位的多寡分为 三种类型：
“小改”：对已知结构的pro进行几个残基的替换 来改善pro的结构和功能；
“中改”：对天然pro分子进行大规模地肽链或结 构域替换以及对不同pro的结构域进行拼接组装；
“大改”，即在了解pro结构和功能的基础上，从 pro一级结构出发，设计自然界不存在的全新pro。
➢蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶 体学和动力学的研究，获取有关蛋白质物理和 化学等各方面的信息，在此基础上利用生物技 术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的 的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界 没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件 的全新蛋白质的过程。
完整版蛋白质工程.pptx
蛋白质工程的崛起
蛋白质工程的概念
享学课堂
是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为 地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去 改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天 然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以 制造新型的蛋白质。
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9
酶工程简介
酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程 学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护 等方面的一门科学技术。由酶制剂的生产和应用两方 面组成的。 酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存 酶的合理充分利用。 蛋白质工程的重点那么在于对已存在的蛋白质分子的 改造。 随着蛋白质工程的开展，其成果也会应用到酶工程中， 使酶工程成为蛋白质工程的一局部。
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10
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5Hale Waihona Puke ..分割..6〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种 16种
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改 造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
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推测氨基酸序列
依据是什么
依赖于什么工程
投入生产
相应的脱氧核苷酸序列（基因）
..分割..
4
讨论
讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： …—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯 丙氨 酸—… 〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种？
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
蛋白质工程的概念
享学课堂
是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为 地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去 改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天 然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以 制造新型的蛋白质。
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酶工程简介
酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程 学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护 等方面的一门科学技术。由酶制剂的生产和应用两方 面组成的。 酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存 酶的合理充分利用。 蛋白质工程的重点那么在于对已存在的蛋白质分子的 改造。 随着蛋白质工程的开展，其成果也会应用到酶工程中， 使酶工程成为蛋白质工程的一局部。
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5Hale Waihona Puke ..分割..6〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种 16种
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改 造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
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推测氨基酸序列
依据是什么
依赖于什么工程
投入生产
相应的脱氧核苷酸序列（基因）
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4
讨论
讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： …—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯 丙氨 酸—… 〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种？
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
《蛋白质工程概述》PPT课件
采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白 产物 分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用
整理ppt
9
蛋白质改造常用方法
生物技术制药
理性方法
定位突变 区域性定向突变 从头设计
非理性方法 随机广泛突变 分子重排
整理ppt
10
生物技术制药
（一）定点突变改进蛋白质
基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失 基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来 改造蛋白质的方法。
整理ppt
2
基因工程与蛋白质工程的区别：
基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的 基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型， 但这只能合成自然界固有的蛋白质。
蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将 克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成 新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿 主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、 有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新 的蛋白质分子。
蛋白基因
新突变质粒
核苷酸片段
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14
PCR诱变
双链DNA变性
94 oC，1 min
退火，引物结合
54 oC，45 s
链延伸
72 oC，2 min
整理ppt
15
生物技术制药
依赖高保真 DNA高温聚 合酶的PCR 直接点突变
整理ppt
16
（二）采用融合蛋白技术改进蛋白 质
概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白 结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是 原核序列，羧基端是真核序列。
原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码 子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白 质基因，可实现2个基因的融合表达。
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蛋白质改造常用方法
生物技术制药
理性方法
定位突变 区域性定向突变 从头设计
非理性方法 随机广泛突变 分子重排
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生物技术制药
（一）定点突变改进蛋白质
基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失 基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来 改造蛋白质的方法。
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2
基因工程与蛋白质工程的区别：
基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的 基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型， 但这只能合成自然界固有的蛋白质。
蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将 克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成 新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿 主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、 有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新 的蛋白质分子。
蛋白基因
新突变质粒
核苷酸片段
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PCR诱变
双链DNA变性
94 oC，1 min
退火，引物结合
54 oC，45 s
链延伸
72 oC，2 min
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生物技术制药
依赖高保真 DNA高温聚 合酶的PCR 直接点突变
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（二）采用融合蛋白技术改进蛋白 质
概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白 结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是 原核序列，羧基端是真核序列。
原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码 子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白 质基因，可实现2个基因的融合表达。
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生物化学课件-protein-engineering蛋白质工程全
Glycosylated cC I66Q/I108T
Fig. Proposals to explain how glycosylation affect the fibrillization mechanism.
17(2)-29
思考题
1、中心法则的含义 2、基因工程的概念及其基本步骤 3、蛋白质工程的概念和基本方法 4、举例说明蛋白质工程在改善蛋白质功能方 面的应用 5、生物工程与基因工程、蛋白质工程的关系
形代表由Thr40, Ile55和Ser91等构
成疏水中心.
17(2)-16
通过蛋白质工程对溶菌酶的改造
• 热稳定性的提高
– 加强疏水中心：S91T – 点突变，引进糖链
• 抗菌范围的扩大
– 融合疏水性短肽片断
17(2)-17
19位和49位氨基酸突变而糖基化的溶菌酶
Asn19-Tyr20-Arg21 Asn19-Tyr20-Thr21
• 枯草杆菌蛋白酶
– 洗衣粉的添加酶制剂 – 工业酶制剂中市场最大
• 增强抗氧化性？
• 理论设计：
– 改进Met222
枯草杆菌蛋白酶活性中心构造图
17(2)-9
增强抗氧化性的定点突变
222位氨基酸单点突对变于枯野草生杆型菌的相蛋白酶与22野2位生氨型基的酸比活比对较于野生型的相
对比活 (％)
对比活 ( ％)
第十七章 基因工程和蛋白质工程
17(2)-1
第三节 蛋白质工程
• 概念：重点 • 一般技术； • 应用示例
17(2)-2
* 蛋白质的广泛功能
• 酶的催化作用: –SOD,植酸酶,酪氨酸酶,角蛋白酶,凝血酶，溶菌酶
• 信号传递：膜受体蛋白把信号传入细胞内部。 • 转运与贮存:
《蛋白质工程》PPT课件
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蛋白质创造和改造
• 蛋白质的改造，从物理、化学法到基因重组。
➢物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处 理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改 变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体 构像等等；
➢生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白 质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连 接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发 生胶连等等。
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结构、功能的设计和预测
• 根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数 据库里的数据，预测一定氨基酸序列肽链空间结 构和生物功能；可以根据特定的生物功能，设计 蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组 等实验直接考察分析结构与功能之间的关系；
• 通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、 同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析 计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这 方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立 一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系， 用以设计、预测蛋白质的结构和功能。
蛋白质工程
Protein engineering
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1
Protein engineering
➢蛋白质工程是应用科学，目的是获得有用或有价 值的蛋白质。
➢这是一个年轻的学科，目前，蛋白质工程尚未有 统一的定义。
➢一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变 或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。
➢蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子 生物学、分子遗传学学科基础上，融合了蛋白质 晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅 助设计等多学科而发展整理起ppt 来的新兴研究领域 2
16
定向进化与自然进化
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§4-1 酶工程的产生及发展历史
人类对酶的认识历程 酶制剂的生产 固定化酶 分子修饰 非蛋白酶类-未来
人类对酶的认识历程
• 1578年，Kunne首先提出酶的概念 • 1833年，Payen和Persoz获得淀粉酶 • 1894年，Fisher发现酶的专一性 • 1896年，Bucher兄弟提出发酵本质认识 • 1903年，Henri提出酶底物配合说 • 1913年，Michaelis-Menten方程 • 1927年，Summer证明酶也是蛋白质 • ……
本章重点
• 蛋白质工程确立的历史事件 • 蛋白质工程的概念 • 蛋白质合成的分子学基础及过程 • 蛋白质工程的研究内容
酶工程（英语：Enzyme engineering）是指工业上 有目的的设置一定的反应器 和反应条件，利用酶的催化 功能，在一定条件下催化化 学反应，生产人类需要的产 品或服务于其它目的的一门 应用技术。
合成过程
• DNA→mRNA→蛋白质 • mRNA的阅读5’→3’；肽链的合成N端→C端 • 从mRNA到肽链的秘密 • 肽链之前和肽链之后（合成过程三阶段）
密码子表
蛋白合成过程示意
§3-3 蛋白质工程的内容及过程
理论背景 内容 程序 与基因工程的关系
理论背景
• 序列——结构——功能之间的内在联系
酶工程的定义
酶工程（英语：Enzyme engineering）是指工业上有目的的 设置一定的反应器和反应条件，利用 酶的催化功能，在一定条件下催化化 学反应，生产人类需要的产品或服务 于其它目的的一门应用技术。
主要内容
§4-1 酶工程的产生与发展历史
§4-2 酶学基础及酶工程定义
§4-3 生物酶工程 §4-4 化学酶工程
蛋白质工程的产生及意义
• 1982年，Winter 提出定点诱变 • 1983年，Ulmer发表专论，标志
意义： • 蛋白对生命的重要所在 • 蛋白质工程的难点：结构和功能间的关系
§3-2 蛋白质ห้องสมุดไป่ตู้生物合成
蛋白质的结构 三个配体（RNA） 合成过程
蛋白质结构基础1
• 氨基酸 • 肽键
氨基酸的通式
内容
• 理论上的研究：序列→结构→功能
• 应用上的分类：小改（1-n个氨基酸） 中改（肽端或结构域） 大改（从头设计）
具体程序
• 从功能设计到功能实现的反馈。
§3-4 蛋白质工程的具体应用
提高蛋白稳定性 增加活性 融合蛋白 嵌合抗体和人缘化抗体
课外书籍资料
• 蛋白质结构模拟与设计，李荣秀，化学工业出版社， 2011
谐音 假 设 来 写 一 两 本 书
名称 三字 单字 谷氨酰胺 Gln Q 天冬氨酸 Asp D 酪氨酸 Tyr Y 丙氨酸 Ala A 丝氨酸 Ser S 天冬酰胺 Asn N 半胱氨酸 Cys C 谷氨酸 Glu E 脯氨酸 Pro P 甘氨酸 Gly G
谐音 五 天 烙 饼 四 天 半 苦 不 干
分子修饰
• 酶分子修饰是通过对蛋白酶主链的剪接和侧 链的化学修饰对酶分子进行改造，以改变酶 的一些性质，创造出天然酶不具备的优良性 状，扩大酶的应用已达到较高的经济效益。
• 注意区分分子修饰所用的手段
酶分子修饰的手段
1、金属离子置换修饰：改变酶分子中所含的金属离子。常用 离子：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。
主要内容
§3-1 蛋白质工程的发展历史
§3-2 蛋白质的生物合成
§3-3 蛋白质工程的内容及过程 §3-4 蛋白质工程的具体应用
§3-1 蛋白质工程的发展历史
蛋白质的历史起源 蛋白质工程的产生 蛋白质工程的意义
蛋白质概念的历史渊源
• 旧称：朊 • 1728年，Beccari洗出面筋 • 1838年，荷兰科学家格里特发现蛋白—— • 1841年，Liebig发表文章 • 1883年，Kjedahl发明定氮，发现氨基酸 • 1902年，确定氨基酸结构，测定肽键性质 • 1927年，发现酶也是蛋白 • ……
• 组成蛋白质的常见氨 基酸有二十种 ，通式 如下：
• R不同，组成的氨基 酸就不同
名称 三字 单字 甲硫氨酸 Met M 色氨酸 Trp W 赖氨酸 Lys K 缬氨酸 Val V 异亮氨酸 Ile I 亮氨酸 Leu L 苯丙氨酸 Phe F 苏氨酸 Thr T 精氨酸 Arg R 组氨酸 His H
2、大分子结合修饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空 间结构发生精细改变。常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝 素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。
3、酶侧链水解修饰(肽链有限水解修饰)：肽链经有限水解，使 酶的空间结构发生某些精细改变。酶蛋白主链修饰主要是靠酶 切/酶原激活法。
4、酶分子的侧链基团修饰：采用一定的方法（化学法）使酶 蛋白的侧链基团发生改变。侧链基团改变引起酶蛋白空间构象 的改变，从而改变酶的特性和功能。基团有：羧基、氨基、巯 基、咪唑基、酚羟基、胍基、色氨酸吲哚基。
酶制剂的生产
• 1894年，日本高峰让吉制备高峰淀粉酶 • 1908年，Rohm制得胰酶 • …… • 1949年，细菌淀粉酶发酵—— • 1960年，Jacob和Monod阐明酶合成机制 • ……
固定化酶
• 1916年，Nelson和Griffin发现酶固定现象 • 1953年，Grubhofer和Schleith明确固定化 • …… • 1978年，日本人实现细胞固定化 • ……
• 蛋白质组学研究 概念、技术及应用，张丽华，科学出 版社，2010
• 蛋白质研究技术，颜真，第四军医大学出版社 ，2007 • 合成一个蛋白质，熊卫民，山东教育出版社，2005 • 重组蛋白分离与分析，范代娣，化学工业出版社，
2004
课外视频资料
• DNA生命的控制器 • 从DNA到蛋白质 • 国外大牛制作RNA聚合酶…… • DNA复制转录和翻译 • DNA复制 • 基因指导蛋白质合成
肽键、肽和多肽
蛋白质结构基础2
• 一级结构 • 二级结构 • 三级结构 • 四级结构 • 功能与结构密切相关
三种RNA
• mRNA——程序 • rRNA（核糖体）——装配车间 • tRNA——运载工具
mRNA
三种RNA的协同工作
• mRNA——程序 • rRNA（核糖体）—
—装配车间 • tRNA——运载工具