荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用

Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用李华芝李秀艳徐亚同（华东师范大学资源与环境学院环境科学与技术系上海，２０００６２）摘要该文综述了荧光原位杂交技术的发展、技术原理及其在环境微生物群落研究中的应用，还探讨了该技术在应用中存在的问题，并对其应用前景进行了展望。

关键词荧光原位杂交１６ＳｒＲＮＡ寡核苷酸探针微生物群落结构ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）ｔｏＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅＬｉＨｕａｚｈｉＬｉＸｉｕｙａｎＸｕＹａｔｏｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６２，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｉｔｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＦＩＳＨｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｎｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｅｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ，ｉｔｓｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｓｈｏｒｔａｇｅｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎａｎｅｘ－ａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｗｅｒｅｅｘｐｅｃｔｅｄａｂｏｕｔｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＦＩＳＨ１６ＳｒＲＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ微生物是生态系统的重要组成部分，在各种元素的生物进化循环中起着关键作用。

因此，研究微生物的群落结构，借此了解微生物和环境的关系尤为重要。

长久以来，微生物群落结构的调查方法一直是建立在分离和培养的方法上，这种方法不但费时费力，而且不能精确地反映混合菌群的组成和多样性，对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果［１］。

因此用传统培养方法所得出的调查结果不能准确反映微生物群落的组成情况，建立和发展一种不依赖微生物培养的方法来进行微生物群落结构研究是非常必要的。

上世纪８０年代末至９０年代以来，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分析，且发展迅速，研究的焦点集中在具有保守序列的１６ＳｒＲＮＡ上。

研究方法包括分子杂交法、ＰＣＲ法、ＳＳＣＰ法、ＤＧＧＥ法、ＴＧＧＥ法、ＲＦＬＰ法、ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法和克隆基因文库分析法等，具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的优越性，推动了微生物群落结构研究的快速发展。

但是，这些基于ＰＣＲ的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低所得信息的精确度。

荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）作为一种不依赖ＰＣＲ的分子分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充，它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，同时对微生物群落进行评价。

目前，ＦＩＳＨ技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物物学中，已成为微生物群落研究的重要技术手段，对环境中复杂的混合微生物群落进行及时监控和准确鉴定也变得越来越重要，为污染治理和防治提供了新的思路和方法。

１荧光原位杂交技术的发展１９６９年，Ｐａｒｄｕｅ等［２］和Ｊｏｈｎ［３］两个研究小组开发了原位杂交技术，用放射性同位素标记的ＤＮＡ或２８ＳｒＲＮＡ与爪蟾卵细胞制备物进行杂交，进行显微放射自显影检测。

这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下，检测出细胞核酸序列，自此，原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。

１９８８年，Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ等［４］首次将ＦＩＳＨ技术引入细菌学研究中，使用放射性标记ｒＲＮＡ寡核苷酸探针检测微生物。

随着荧光标记的发展，非同位素染料逐渐代替基金项目：国家高技术研究发展８６３计划专项资助（２００３ＡＡ６０１０２０）净水技术ＷＡＴＥＲＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１６－－Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６净水技术了放射性标记。

１９８９年，Ｄｅｌｏｎｇ［５］首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。

与放射性探针相比，荧光探针更安全，具有较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。

此外，可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反应中同时检测几个靶序列。

在短短的十几年中，由于ＦＩＳＨ技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具。

２荧光原位杂交技术的原理荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶ＤＮＡ分子或ＲＮＡ分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪（ＣｏｎｆｏｃａｌＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＣＬＳＭ）下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的ＤＮＡ区域或ＲＮＡ分子在染色体或其它细胞器中的定位。

ＦＩＳＨ技术的目标分子通常是１６ＳｒＲＮＡ，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。

根据待测微生物体内１６ＳｒＲＮＡ中某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测，而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平（如属、种等）上进行检测。

目前，公共和商业数据库中已发布的１６ＳｒＲＮＡ序列逐渐增多，因此，基于１６ＳｒＲＮＡ的ＦＩＳＨ技术的应用也越来越广泛，对环境样品中微生物的原位研究也越来越方便和准确。

除１６ＳｒＲＮＡ外，还可以２３ＳｒＲＮＡ或ｍＲＮＡ等作为研究的目标分子。

ＦＩＳＨ技术成功应用的关键在于设计和获得具有高灵敏性和专一性的寡核苷酸探针。

３荧光原位杂交技术的应用ＦＩＳＨ技术已广泛地应用于微生物生态学和环境微生物学的研究中，其在环境微生物群落研究中的应用主要表现在以下两个方面。

３．１环境样品微生物多样性的研究研究不同的样品时发现显微镜下可见的微生物９９％以上通过常规方法不能被培养，由于培养条件与自然条件的差异，实际上培养所得到的只是自然环境中的少部分微生物，而且往往加入了浓度远高于自然状况的营养物质，其结果是在新的选择压力下群落结构通常会发生变化，适应丰富营养条件的菌种成为优势种，取代了自然条件下的优势种。

由于核酸序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息，可进一步用于鉴定、监测自然生态系统中的微生物。

基于核酸抽提和ＰＣＲ扩增等技术存在一定程度的偏差，而ＦＩＳＨ技术可以将整体微生物清晰地呈现出来而不需要额外的抽提和扩增等易引起偏差的步骤，精确性更好。

所以，ＦＩＳＨ技术被广泛应用于环境微生物多样性的研究，ＳｉｍｏｎＮａｔｈａｌｉｅ等［６］在２００２年利用ＦＩＳＨ技术研究海水中细菌和有害藻类种群之间的相互作用；ＡｒａｙａＲｕｂｅｎ等［７］在２００３年对溪流中和水中生物膜上的微生物群落进行了ＦＩＳＨ研究。

ＭｃｎａｍａｒａＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＪ等利用ＦＩＳＨ技术对美国卡罗莱纳州南部溪流沉积物中可培养和不可培养的细菌群落进行了分析［８］。

应用ＦＩＳＨ技术不仅能研究微生物群落结构的特征，还可以跟踪微生物种群的动态变化。

ＬｉｕＪ等［９］２００２年利用ＦＩＳＨ技术监测了河流中微生物群落的动态变化，并利用此技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种以及一些新的微生物信息。

借助ＦＩＳＨ方法，我们不仅可以更准确地了解不同环境下微生物群落中各种功能菌群的组成比例，而且对不同功能菌群的相互作用有了更直观的认识。

研究表明，自然界中在空间上聚集在一起的不同微生物类群大都在代谢上互惠互利［９］。

３．２污水处理中微生物多样性的研究Ａｒｄｅｒｎ和Ｌｏｃｋｅｔｔ［１０］在１９１４年发明了活性污泥污水处理法，然而在废水处理过程中微生物生态学特性一直没有得到深入研究。

而研究微生物个体、群落多样性及其动态变化对提高处理系统的控制能力具有重要的意义。

常规的方法是通过检测特异底物转化率来研究活性污泥中重要功能菌群的活性，如耗氧速率、硝化、反硝化、磷吸收和释放、Ｆｅ３＋的还原等。

ＦＩＳＨ技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。

放射自显影和ＦＩＳＨ（ＭＡＲ－ＦＩＳＨ）结合被用于研究废水处理系统微生物活性、数目和对特异有机底物的消耗。

１６ＳｒＲＮＡ为靶序列的ＦＩＳＨ检测技术被用于检测活性污泥及生物膜微生物群落结构和数目及其空间分布，同时对特异菌群进行空间定位和原位生理学的研究。

３．２．１微生物群落组成及空间分布的研究ｒＲＮＡ测序和ＦＩＳＨ结合的群落分析广泛用于监测生物反应器或废水处理设施中的微生物多样性。

应用共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）的ＦＩＳＨ技１７－－Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６术可以对生物膜和活性污泥絮体的特异种群进行空间分布研究。

Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ等［１１］应用ＣＬＳＭ－ＦＩＳＨ研究了厌氧反应器的生物膜中的乙酸氧化细菌、脱硫微菌属、产甲烷细菌、硫酸盐还原细菌的分布。

Ａｍａｎｎ［１２］等根据ＰＣＲ扩增的ｒＲＮＡ序列设计寡核苷酸探针，用ＦＩＳＨ技术诊断活性污泥中的微生物群落结构。

Ｓｃｈｒａｍｍ［１３］等在流化床硝化反应器和活性污泥系统中研究了亚硝酸细菌和氨氧化细菌的数量和空间分布。

Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ等［１４］研究了ＵＡＳＢ反应器中高温和中温颗粒污泥的厌氧微生物群落，揭示了微生物的多样性和空间分布，对其原位生理学和功能进行了探讨。

ＬｅｅＴＪ等［１５］利用ＦＩＳＨ技术研究了活性污泥中聚磷酸盐积累型细菌（ＰＡＢｓ）和糖原积累型细菌（ＧＡＢｓ）的数量和空间分布。

３．２．２原位生理学和功能性研究Ｎｉｅｌｓｅｎ等［１６］对工业废水处理厂活性污泥的细菌表面疏水性进行了原位检测，应用ＦＩＳＨ技术结合细胞表面微球体（ＭＡＣ）分析，研究了丝状细菌的胞外聚合物（ＥＰＳ）。

Ｓｃｈｒａｍｍ等［１７］将ＦＩＳＨ和微传感器结合，同时分析微生物群落结构和代谢活性，揭示了厌氧微生物在有氧环境中的缺氧微生态位。

近年来，绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）分子被应用到微生物生态学的研究中，将不同的基因插入微生物的质粒或染色体ＤＮＡ，表达的绿色荧光蛋白分子能在单细胞水平可视化和监测启动子活性或基因中表达。

Ｍｏｌｌｅｒ等［１８］研究了生物膜的微生物空间分布、启动子诱导及其表达的时序进程，同时对菌群间的相互影响进行了分析。

３．２．３特殊菌种的研究在污水处理过程中，硫酸盐还原菌与产甲烷细菌存在着生存竞争，因此，硫酸盐还原菌的研究受到了较多的关注。