Zn2+和金属硫蛋白在细胞内表达的关系

(资料来源：Katakai等，2000)
表明：NO置换了MT中的Zn2+，引起其中的Zn2+释放进入细胞质。
其他物质诱导MT表达是否也是通过释放MT中的锌实现的呢？
3.2.2
H2O2诱导MT中Zn2+释放引起MT的表达
图11 H2O2诱导人的色素上皮细胞MT的表达
（资料来源：Tate等， 1995)
Zn2+和金属硫蛋白在细胞内表达的关系
主要英文缩写符号说明
MRE：金属反应元件 MT ：金属硫蛋白 apo-MT:金属硫蛋白前体物 SH ：巯基 NLS：核定位序列 PKC：蛋白激酶C MTF-1 :金属转录因子 apo-MTF-1:无活性的金属转录因子 JNK：c-Jun氮端激酶 -TGCRCNC-：MRE核心区域共有序列
细胞中MT以不含有Zn2+的apo-MT形式存在时，H2O2不能诱导MT基 因的表达（Zhang等，2003）。
说明H2O2诱导MT的表达对Zn2+可能具有依赖性。
3.2.3
重金属离子诱导MT中的Zn2+引起MT的表达
图13 胞内铜浓度的改变对MT-1mRNA水平的影响
（资料来源：Mcardle等， 1990)
（资料来源：Lindert等，2009）
表明：丙酮酸激酶（myc-pk)的核定位是依赖于MTF-1上面的 NLS序列以及其锌指F1-F3共同的作用。
图34 人的MTF-1的氨基酸133-226序列是其核定位必须的
（资料来源：Lindert等，2009）
表明：人的MTF-1的氨基酸133-226序列是其核定位必须的，因此， MTF-1上的NLS序列和其锌指F1-F3一起作为MTF-1核定位的新的 功能序列SNAIL1。
研究发现，使用apo-MT处理过量的Cu2+和Cd2+时，均不能诱导细胞中 MT-1基因的表达(Zhang等，2003） 。
说明Cu2+,Cd2+诱导MT在胞内的表达可能和Zn2+有关。
哺乳动物的MT主要结合胞内的Zn2+（Kagi ，1991），在Cu2+和Cd2+过 载的情况下，Zn2+可以被很容易的取代（Shaw等， 1991）。
说明，Zn2+引起了MTF-1在细胞质中的激活过程，并且其激活 过程是发生在MTF-1从细胞质向细胞核的核转运过程中。
图17 老鼠体内MTF-1的激活仅仅是Zn2+的作用
图18 人胚肾细胞中，Zn7-MT的存在， 促进MTF-1的激活
MTF-1
(资料来源：Bittel等， 1998）
（资料来源：Zhang等，2003）
3.2 外源性诱导胞内Zn2+浓度升高引起MT的表达
MT是胞内数量最多的锌结合蛋白,对Zn2+有很高的亲和性，Zn-MT在 基因表达和信号传递等过程中发挥重要作用（Satoh,等 1999)。
图5 MT维持胞内Zn2+稳态模拟图 图6 细胞核中锌浓度与MT在细胞中表达的关系
（资料来源：Tang等，2002）
Zn-MT结构是半胱氨酸配基诱导MT氧化还原反应的化学基础（Maret,1998）
图9 NO诱导马的肾上皮细胞MT中Zn2+的释放伴随着巯基的减少
（资料来源：Kroncke, 1994)
表明NO破坏了Zn-S结构，使Zn2+从MT中释放出来进入胞质中。
图10 G75凝胶色谱仪分析老鼠肝脏上皮细胞胞质溶胶中加入Zn2+以及Zn2++DETA/NO后的MT中Zn2+变化
Zn2+激活MTF-1的两种模型：
图27：Zn2+激活MTF-1的两种模型：
模型A：Zn2+结合在弱Zn2+结合区 域（F5,F6),导致分子内变构激 活MTF-1。
模型B：Zn2+与F1可逆的结合， 消除阻碍F2-F4与F6相互作用的 影响因素导致MTF-1的激活。
（资料来源：Chen等，1998）
图32 老鼠纤维母细胞锌处理MTF-1的锌指F1缺失之后的核质MTF-1变化
（资料来源： Bittel等，2000）
表明：锌指F1单独存在可能并不影响MTF-1的核定位，MTF-1的核 定位过程可能还依赖于其分子上其他功能区域的作用。
图33 人的MTF-1的锌指F1-F3足够引起丙酮酸激酶（myc-pk)的核定位
MT-1,MT-2
抵御金属离子的毒性和氧化应激
功能特 异性
大脑的神经元和神经胶质
MT-3
参与神经细胞的生存以及轴突的形成
复层鳞状上皮细胞
MT-4 表达角质素，促进上皮细胞的角质化
参考文献： Andrews，1990； Toriumi等, 2005 ；Quaife等，1994
锌是动物必需的一种微量元素，它能与DNA或者其他 蛋白质相互作用，在所有锌依赖的酶和组织蛋白中发挥重 要的催化和结构功能（Gaither等，2001）.
假定的核定位序列（NLS）和核输出序列（NES)(图a,c)(Saydam，2001)
Chen（1998）CD分析MTF-1的F1-F6锌指结构发现其在222nm处具 有相同的A值，而与Zn2+在其锌指半胱氨酸上的结合位置无关！
图20 MTF-1的锌指无序性
（资料来源：Potter等， 2005）
Zn2+
MT在细胞内表达
二﹑MT的结构
MT的一级结构
MT一般是由60一68个氨基酸残基组成的多肽单链．分子中含有大量巯 基，但不存在二硫键，在自然条件下，所有的巯基均与金属离子结合 （Binz等，1999）．
图1 老鼠四种MT亚型的氨基酸序列
（资料来源：Meloni等，2006）
分子量少于10，000Da；含有4-12个金属离子／分子；有丰富的Cys— X—Cys序列结构域；缺乏芳香族氨基酸，组氨酸含量极少．
4.2 Zn2+和MTF-1的核定位
Zn2+能够加速MTF-1向细胞核的转运过程（Smirnova，2000）
图28 MTF-1的核转运有时间和浓度依赖性 图29 MT敲出型小鼠肺上皮细胞中MTF-1的 核转运数量降低
（资料来源：Saydam等，2001）
（资料来源：Stitt等，2006)
说明： Zn2+引起了MTF-1的核定位过程。
图3 老鼠MT-2分子的三维结构模型图 图4 脊椎动物和酵母中两种金属硫醇盐簇形式
S
（资料来源：Vasak， 2005)
三、Zn2+和MT在细胞内的表达
3.1 外源性添加锌诱导MT的表达
MT的mRNA在老鼠肝脏，肠道，肾脏的表达受到Zn2+的调节。 （Blalock,1988)
研究对象 肾小管上皮 细胞 鼠 研究内容 Zn2+刺激肾小管上皮 细胞 研究结果 资料来源 Harford ，1991
现象2：MTF-1的激活主要依赖于锌指F5,F6,而不是F1。
图25 SDS分析MREd存在下，胰蛋白酶处 理Zn6-MTF-1zf随时间的变化 图26 烷基化处理F1-F6中各个巯基后，各锌 指中半胱氨酸残基的反应活性比率
(资料来源：Chen等， 1999)
资料来源：（Apuy等， 2001）
说明MTF-1的锌指F5,F6对锌的亲和能力要强于锌指F1-F4.因此F5,F6 可能是作为MTF-1的功能锌指，而F1-F4是作为结构锌指。
图30 人的MTF-1中NES和NLS序列
F1
（资料来源：Saydam,2001） 图31 Zn2+诱导NLS突变体的MTF-1向细胞核内的运输被推迟
（资料来源：Saydam等，2001)
Bitter(2000)研究发现，MTF-1中的锌指F1对于MTF-1与DNA的结合 活性有很重要的作用，而不是F2-F6的作用。
细胞中的Zn2+是怎样诱导MT在胞内 表达的呢？
四、Zn2+介导MT在细胞内表达的机制
MTF-1是Cys2-His2家族的一个锌指转录因子（Radtke，1993），也 是基础条件和重金属诱导下，MT表达所必需的（Heuchel等，1994） MRE是一个12bp短序列，它是MTF-1在DNA序列上的一个结合点， 金属离子的应答性反应依赖于MRE序列（Cizewski等，1989）。
这说明锌指F1-F6可能具有不同的功能性质。
研究表明：存在两种锌依赖的激活MTF-1的现象。
现象1：MTF-1的激活主要依赖于锌指F1,而不是F5,F6。
图21 MTF-1锌指缺失后与DNA结合的活性 图22 缺失F1,F5,6后，MTF-1在酵母上的功能活性
（资料来源：Bittel等，2000）
图15 MRE存在于MTF-1调节基因的临近启动子序列上
（资料来源：Andrews，2001）
MTF-1是结合在MREs的功能区域发挥其作用（Koizumi，1999）
4.1 Zn2+和MTF-1在胞质中的激活
图16 蛋白质印迹和电泳分析Zn2+处理后，MTF-1在细胞核的蓄积和其活性形式的改变
（资料来源：Smirnova, 2001）
肝细胞
神经瘤细胞 红细胞
Zn2+诱导老鼠肝细胞
Zn2+刺激老鼠神经瘤 细胞 Zn2+刺激人的红细胞 中MT含量变化
Hidalgo，1990
Ebadi， 1988 Sullivan等，1998
人
单核细胞
Zn2+诱导人的单核细 胞
Mesna ，1990； Sullivan等， 1998
外源性诱导细胞内锌浓度的升高是否也会引起MT的表达呢？
图23 缺失锌指F1，F5-6的 MTF-1,短暂转 染老鼠纤维母细胞（MTF-1-/-)后的功能
图24 缺失锌指F1，F5-6， MTF-1,短暂 转染果蝇SL2细胞后的功能
（资料来源： Bittel等，2000）
说明锌指F1可能作为激活细胞质中的apo-MTF-1的一个功能锌指，而 锌指F5,F6则是作为MTF-1的结构锌指，参与MTF-1的结构组成。
（资料来源：Jayasurya等,2000）
说明细胞中Zn2+浓度的升高能够百度文库起MT的表达。
研究表明：细胞中加入外源性诱导剂，如NO,H2O2，重 金属离子也会引起MT的表达，而这种诱导都是通过释 放MT中的Zn2+实现。
这几种外源性诱导剂诱导细胞内Zn2+浓度的升高，其作 用方式是否相同？
3.2.1
图14 老鼠肝脏Cd2+,Zn2+--MT-2三维结构
Cd
Zn
（资料来源：Chiaverini，2010)
表明Cu2+,Cd2+诱导MT的表达，也是通过置换其中的Zn2+引起。
以上研究表明：细胞中直接添加Zn2+或外源性诱导剂 NO﹑H2O2和重金属离子均可以释放MT上的Zn2+，诱导MT自 身的表达，所以Zn2+是MT表达的一个必需成分。
NO诱导MT中的Zn2+释放引起MT的表达
图8 外源性NO供体提供的NO与Zn2+均引起 MT-1,MT-2的mRNA的表达 Zn2+ NO
图7 iNOS衍生的NO引起鼠动脉上皮细胞 中MT-1,MT-2的mRNA的表达 MT-1 MT-2
NO
Zn2+
（资料来源：Spahl，2003）
表明内源性和外源性NO均可以诱导细胞内MT的表达。
研究对象 研究内容
MT能够维持细胞内的锌离子稳态 小鼠日粮中锌的缺乏和过量均会 引起机体MT的表达
资料来源
Cousins，1985 Kelly等，1996 Dalton,1996 Palmitre等，1996
鼠
转基因小鼠会大量表达MT-1抑制 日粮中锌的缺乏 饲喂锌缺乏日粮会影响老鼠胰脏 的MT浓度和其mRNA的水平
MT的空间结构
图2 F/R探针的MT三维结构
1
MT整个分子 呈哑铃形。 由α 和β 两 个大小相近 的球形结构 域组成。
2
两个结构域 通过第30， 31位的残基 (铰链区)相 连。
（资料来源：Maret等，2002)
MT分子中没有α -螺旋和β -折叠肽段，一分子的MT可以结合7个Zn 或Cd(Michalska等，1996）。在MT分子中，每三个硫基与一个金 属离子形成复合物（Hamor ，1986)。
表明MTF-1在胞内的激活过程是由Zn2+引起，其他金属离子诱导细胞 质中MTF-1的激活也是依赖于其中的Zn2+的作用。
那么，Zn2+是怎样激活MTF-1的呢？
MTF-1的区域结构
图19 老鼠MTF-1蛋白的主要区域结构
（资料来源：Laity等，2007)
老鼠MTF-1蛋白由675个氨基酸组成，包括一个含有6个Cys2-His2的锌指 DNA结合区域（图b)和三个转录激活区域(图c)（Radtke等，1993），以及
报告内容
前言
MT的结构 Zn2+和MT在细胞内的表达 Zn2+介导MT在细胞内表达的机制 结语 参考文献
一﹑前言
1957年Margoshes,Vallee首次在马的肾脏中发现MT ，到目前为 止共发现170多种MT分子，包括MT-1～MT-4的四种基因类型。
（Sundar等，2006） 所有组织和细胞