单向免疫扩散试验1
项目四 单相免疫扩散试验
项目四单相免疫扩散试验(Single immunodiffusion test)【实验原理】单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。
将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。
抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。
【试剂和器材】1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。
2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。
3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。
4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。
5．水浴箱、水平台。
【步骤和方法】1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。
取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。
2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。
将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。
用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。
3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。
要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。
标准抗原孔待检血清孔图1-4单相免疫扩散试验4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。
将待检血清用生理盐水1:50稀释。
按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。
表1-3 血清稀释表稀释倍数12.5 25 50 100 200IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.25．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。
单向免疫扩散图片分析系统用于流感疫苗血凝素含量测定
单向免疫扩散图片分析系统用于流感疫苗血凝素含量测定章春宇1 石 晶2(1 长春医学高等专科学校药学系 吉林长春 130031;2 东北师大基因工程有限公司吉林长春130024)摘 要 本文建立了一种基于自主研发图片分析软件的单向免疫扩散(S R I D)分析方法,通过SR ID图片导入、图片数据采集、数据分析、系列标准品误差分析、数据存储输出等环节完成抗原或抗体含量的分析工作。
该方法操作简单,自动化程度较高,省时省力且误差较小,适用于疫苗的大规模生产检验。
应用S R I D图片分析系统对H1N1型流感裂解疫苗进行血凝素含量测定,同时与传统手工测量方法进行比较,从线性、重复性、回收率三个方面对该系统进行验证。
线性测量结果表明,SR ID图片分析系统标准曲线的相关系数均大于0 99,且平均相对偏差为0 21%;手工方法测量的相关系数低于0 99,平均相对偏差为1 14%。
S R I D图片分析系统重复性试验的相对偏差、变异系数均较游标卡尺方法小,重现性较好。
回收率试验结果表明,SR ID图片分析系统测量值与真实值基本一致,回收率相对平均偏差均小于1%,游标卡尺测量方法测量值与真实值存在一定偏差,相对平均偏差大于4%。
关键词 图片分析系统 单向免疫扩散 血凝素 流感疫苗由于流感病毒主要表面抗原血凝素(H e m ag glutinin,HA)和神经氨酸酶(Neura m idi n ase,NA)经常发生变异,从而逃避机体免疫系统,因此易感人群(老人、新生儿及其他免疫力低下群体)每年均需接种流感疫苗[1]。
由于需根据WHO每年公布的毒株进行流感疫苗的生产,也为生产企业带来了时间压力[2]。
因此建立一种简便快速的流感疫苗质量控制方法具有重要实践意义。
应用单向免疫扩散方法(Sing le Radia l I m m u nod iffusion,SR I D)进行抗原或抗体含量的测定已广泛应用于生物医药的检测、分析及质量控制领域。
免疫沉淀类试验——双扩、免疫比浊1解析
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
③不宜用于药物等半抗 原的测定；
④灵敏度较散射比浊法 低。
2 散射免疫比浊法
原理：
散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到 小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转， 这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同 而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角 度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复 合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复 合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散 射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比 浊法(endpoint nephelometry)。
沉淀反应
微生物与免疫教研室
沉淀反应（precipitation）
是可溶性抗原与相应抗体在 适当条件下发生特异性结合所出 现的沉淀现象。
分类
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 环状沉淀试验
沉
免疫浊度测定
淀
反 应
单向免疫扩散试验 免疫扩散
双向免疫扩散试验
凝胶内沉淀试验
免疫电泳
火箭免疫电泳 对流免疫电泳
沉淀反应的特点
• 抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖 • 沉淀反应分两个阶段：
– 第一阶段、抗原抗体特异性结合 – 第二阶段、形成可见的免疫复合物
免疫浊度测定
经典的沉淀试验有4个缺点无法克服： ① 操作繁琐 ② 敏感度低（10～100μg/ml） ③ 时间长 ④ 难以自动化
第一部分免疫球蛋白测定一、IgG、IgA、IgM的测定1、单向
三、M蛋白测定：——免疫电泳
M蛋白： 浆细胞或B淋巴细胞单克隆增殖产生的结构均 一的多无活性的单克隆免疫球蛋白。 方法步骤：血清蛋白电泳加抗体于琼脂槽内扩 散、沉淀 结果判断：在α2-γ区附近形成致密弓形沉淀弧 临床意义：主要见于多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，也可见于巨球蛋白血症 mactoglobulinemia)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)和重链病
2、变应原特异性IgE检测：放射变应原吸附 试验（radioallergosorbent test,RAST) 步骤：变应原交联载体 加待检血清或正常 对照血清加 125I-抗人IgE 洗去未结合 125I-抗人IgE γ计数器测放射值 结果判定：以大于正常人3.5倍为阳性 临床意义： (1) 参见血清总IgE测定 (2) 确定变应原
散射比浊法
参考值：IgG：12.87±1.35g/L IgA：2.53±0.34g/L IgM：1.08±0.24g/L 临床意义： 1、低Ig血症： 先天性 — 体液免疫缺陷、联合免疫缺陷病 获得性 — 淋巴肉瘤、肾病综合征等 2、高Ig血症： 慢性感染、自身免疫病（类风湿性关节炎等）
二、IgE测定 1、血清总IgE测定：－ELISA法 方法：抗IgE包被反应板 IgE标准品或待 测血清 酶标记抗IgE 底物显色 测吸光度 做标准曲线求待测IgE含 量 参考值：男：631±128 IU/ml 女：337±60 IU/ml 临床意义： 含量增高：特应性皮肤病、枯草热、哮喘、 过敏性休克等
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重， 相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
单向扩散试验实验报告
一、实验名称单向扩散试验二、实验目的1. 了解单向扩散试验的原理和操作方法。
2. 掌握实验操作技巧，提高实验操作能力。
3. 分析扩散速率和扩散系数等数据。
4. 探究单向扩散试验在实际应用中的作用和意义。
三、实验原理单向扩散试验是一种利用抗原抗体特异性结合原理，通过观察抗原在琼脂凝胶中的扩散情况，以定量测定抗原浓度的方法。
实验中，将抗体加入琼脂凝胶制成免疫琼脂板，打孔后加入待测抗原，抗原在琼脂凝胶中向四周扩散，当抗原与抗体比例适宜时，在两者相遇处形成白色沉淀环。
沉淀环直径与抗原浓度成正比。
四、实验器材与试剂1. 试剂：- 羊抗人IgG血清（兔抗人血清）- 标准参考血清（标准IgG质控物）- 待检人血清（IgG-抗原）- pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）- 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）2. 器材：- 载玻片- 打孔器- 37℃恒温箱- 湿盒- 可调微量加样器五、实验步骤1. 制备抗体琼脂板：将琼脂粉与pH7.4 0.01M PBS缓冲液混合，加热熔化，加入羊抗人IgG血清，搅拌均匀后，倒入载玻片制成琼脂板。
2. 打孔：用打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为5毫米。
3. 加样：用微量加样器将标准参考血清和待检人血清分别加入中央孔和周围孔中。
4. 置于湿盒中：将加样后的琼脂板放入湿盒中，置于37℃恒温箱中扩散24~48小时。
5. 观察结果：观察琼脂板上的沉淀环直径，分析抗原浓度。
六、结果与分析1. 标准曲线绘制：以标准参考血清的浓度为横坐标，对应的沉淀环直径为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待检血清抗原浓度测定：将待检血清的沉淀环直径代入标准曲线，求出待检血清的抗原浓度。
3. 结果分析：根据实验结果，分析待检血清中抗原浓度与临床诊断的相关性。
七、结论本实验通过单向扩散试验成功测定了待检血清中抗原浓度，验证了实验原理和操作方法。
实验结果表明，单向扩散试验具有较高的灵敏度和特异性，适用于临床检测和科研工作。
1.单向免疫扩散
第二十四章免疫诊断免疫学检测技术已广泛应用于医学和生物学领域的研究。
在临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、发病机制的研究，病情监测与疗效评价等。
如传染病、免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤、移植排斥反应、超敏反应等。
随着免疫学理论的进展和相关技术的发展，检测技术也不断发展和更新，新方法层出不穷。
本章仅介绍免疫诊断常用技术的原理、基本步骤及其应用。
第一节抗原或抗体的检测一、抗原抗体反应的原理抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的抗原决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，在经典的凝集试验及沉淀试验中，有盐离子存在时，多分子聚合，如分子比例恰当出现肉眼可见反应。
（一）抗原抗体反应的特异性一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。
抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示，前者指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度，后者指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。
抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，它们空间构象的互补程度不同，结合力强弱也不同，互补程度越高，亲和力越高。
此外，反应的条件与抗原抗体的结合力也有关系。
例如适宜的温度、酸碱度、离子强度等能促进抗原抗体分子的紧密接触，增强分子间引力，促进分子间相互结合。
用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗）。
由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体（简称二抗）。
用上述免疫接种方法制备的血清习惯上称为抗血清(antiserum)。
抗血清在免疫学检测中十分常用。
例如，用某种细菌免疫家兔制备的抗血清含有一抗，而将兔血清Ig免疫绵羊可制备出羊抗兔Ig血清，即二抗。
在检测标本中的某种细菌时，可单独使用一抗，因为一抗与该细菌的结合是特异的；也可在使用一抗后再加用二抗，通过二抗与一抗特异性结合，来检测一抗所识别的细菌。
单向双向免疫琼脂扩散
火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上， 可以查出待检样品中抗原的含量。
实验原理
标准品抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
不同病人抗原浓度测定
绘制标准曲线
实验方法
（一）标准曲线的制备
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。
实验
单向、双向免疫琼脂 扩散
沉淀反应
可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件 （适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼 可见的沉淀现象。
沉淀反应
环状沉淀反应
沉
淀
反
琼脂扩散试验
应
对流免疫电泳
电
双向扩散
＋
单向扩散
泳 技 术
絮状沉淀反应
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
免疫检验考试辅导：单向扩散试验
单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。
1、试管法：将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。
2、平板法：是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48h后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。
有两种计算方法：l）Mancini曲线：适用大分子抗原的和长时间扩散（>48h）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系c/d2=k.（其中c为抗原浓度 d为沉淀环直径 k为常数）
3、单向扩散试验检测时的注意点：
（1）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。
（2）每次测定都必须作标准曲线。
（3）每次测定时必须用质控血清作质控。
（4）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。
（5）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。
医学检验部分简答和名词解释
免疫应答主要分为哪几个阶段？1）识别阶段2）活化和增值阶段3）免疫效应中枢免疫器官和外周免疫器官有哪些器官组成？各有什么功能？1）中枢免疫器官：免疫细胞发生、分化、成熟的场所，如骨髓，胸腺2)外周免疫器官：免疫细胞产生应答的场所。
如脾脏，淋巴结，黏膜，扁桃体等。
T细胞、B细胞和NK细胞的主要功能分别是什么？1）T细胞：介导细胞免疫，辅助体液免疫。
2）B细胞：产生体液免疫3）NK细胞：介导天然免疫，发挥细胞毒作用。
根据作用方式及其特点的不同，机体存在两类免疫简述各自的概念和特征？1)先天性免疫或固有性免疫，是个体出生是就具有的天然免疫，可通过遗传获得，是机体在长期进化过程中逐渐建立起来的主要针对入侵病原体的天然防御功能。
其主要特征是反应迅速，针对外来异物的范围较广，不针对某个特定异物抗原，也称非特异性免疫。
2)适应性免疫，是个体出生后，接触到生活环境中的多种异物抗原，并在不断刺激中逐渐建立起来的后天免疫，也称获得性免疫。
其主要特征是针对某个特定的异物抗原而产生免疫应答，开始的应答过程比较缓慢，一旦建立清除该抗原的效率很高，特异性很强，也称特异性免疫。
简述抗原抗体反应的原理。
答：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的，它们之间的结合是抗原表位与抗体超变区沟槽分子表面的结合简述抗原抗体反应的类型。
答：抗原抗体反应分为五种类型：①颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应；②可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应；③抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应；④细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；⑤免疫标记的抗原抗体反应等。
什么是带现象?答：在抗原抗体反应等价带前后，由于抗体或抗原过量(形成前带或后带)，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少，不出现可见反应，这种现象在做血清学试验时称为带现象。
影响抗原抗体反应的环境条件有哪些?在实验中如何控制这些条件因素?答：环境条件包括：电解质，酸碱度和温度。
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳—单向双向免疫琼脂扩散
注意事项
加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备； 孵育时间应控制在24~48h，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉
淀线的扩散。
双向免疫琼脂扩散
实验原理
可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异 性沉淀线。
实验结果
用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量 （单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
注意事项
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影 响抗体的活性；
加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致； 加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
实验原理
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子 大小及扩散速度相关。
当抗原抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。 依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。
双向琼脂扩散试验的应用
检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
医学免疫学实验： 琼脂免疫扩散实验
第二次实验1：琼脂免疫扩散实验一、实验目的了解并掌握单向琼脂免疫扩散法和双向琼脂免疫扩散法。
二、实验原理1.网格学说可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
当抗原过剩或者抗体过剩时，只能形成微小的沉淀物。
2.单向琼脂免疫扩散法的基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加定量的抗原，抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg / ml 或IU / ml )。
3.双向琼脂免疫扩散法的基本原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原和抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度有关。
当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。
三、实验材料1.单向琼脂免疫扩散法实验材料2％离子琼脂，载玻片，标准马抗人IgG 血清（抗体，工作标准参考蛋白，PBS ( pH 7.2,0.01M)，打孔器（孔径3mm）及打孔模板，微量加样器，湿盒（容器内湿纱布或泡沫塑料），单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50)2.双向琼脂免疫扩散法实验材料1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml载玻片；打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头；抗原：0.5ug/ ml 牛血清白蛋白(BSA )、0.5ug/ ml 人血清白蛋白(HSA )；抗体：兔抗人血清白蛋白、兔抗牛血清白蛋白湿盒。
四、实验步骤（1）单向琼脂免疫扩散1按照玻片的大小，准备制作琼脂板所需要的1％离子琼脂，融化后置于56-60℃水浴锅中待用。
（分装其1/2量的2％盐水琼脂）。
稀释抗体，用pH7.2的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。
第2单元 免疫沉淀类实验概要
实验器材和材料
试剂： 待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG含量为 10.10mg/ml）、羊抗人IgG抗血清（单扩效价1:100）、琼 脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3 。 仪器： 水浴箱、温箱 。 材料： 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧 瓶、湿盒半对数坐标纸等 。
免疫浊度分析系统基本技术流程图
开机 依次打开主机电源、电脑及打印机开关，仪器自行启动， 完成初始化和自检，即可开始工作
参数设置
设置仪器项目和单位等相关参数
试剂装载
将试剂盒放入试剂舱内，根据已定程序扫描相关信息
校准
按已设定的参数和程序进行校准
标本装载
将标本放入标本架，根据已定程序输入工作单
标本测定
按已设定的参数和程序进行测定
实验三
对流免疫电泳
实验原理
在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗 体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大 部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动； 而大部分抗体属于 IgG ，在此种 pH 条件下只带微弱的负 电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中 泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动 抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对 流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉 淀线。
在试验过程中，通过类似双扩的方法，观察各种抗原和 抗体之间的反应及变化。
1 2
玻片上方两孔分别为未处理抗原（1）和未处理抗原制备的抗体（2）； 玻片下方两孔分别为处理后抗原制备的抗体（3）和处理后抗原（4）。
3 4
结果讨论提纲
有哪些理化因素能够导致抗原性发生变化，变化的特点和 意义是什么？
加样：用10μl微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体， 周围孔分别加入不同稀释度的抗原。 温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察 沉淀线。
免疫沉淀类实验
结果判定： 待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查
标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即待 检标本血清中Ig的实际含量。
实验讨论
单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和 线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长， 每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用 此方法除检测人血清IgG 含量外，还可用于健康人群或患 者血清中IgA、IgM 、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含 量的定量测定。
? 操作示意图
浇板
打孔 加样 温育
1
2
6
3
5
4
结果判断 中央孔—抗体成分
周围孔—不同稀释度的抗原 成分（第1~5孔）
第6孔—阴性对照
结果判断
以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为 人血清IgG 的扩散效价。
实验讨论
该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇 后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔 内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若 抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相 同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分 时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀 线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、 浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清 IgG 的检 测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测 AFP 、 HBsAg等，但敏感度低所需时间长。
北华大学 王雪松
实验三 对流免疫电泳
实验原理
在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗 体的扩散具有一定的特点。在 pH8.6 以上的缓冲液中，大 部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动； 而大部分抗体属于 IgG ，在此种 pH 条件下只带微弱的负 电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中 泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动 抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对 流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉 淀线。
单向扩散试验平板法
双向扩散试验 （平板法）
应用
3.抗原性质的分析
双向扩散试验 （平板法）
应用
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
第四节 免疫电泳技术
immunoelectrophoresis technique
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
单向扩散试验 （平板法）
single diffusion test
定量试验
原理：抗体与待测的抗原, 在两者比例合适的部位 结合形成沉淀环。
环的大小与抗原的浓度成 正相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃ ），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
免疫电泳原理，不同之 处是将抗血清直接加于电泳 后的蛋白质区带表面，抗原 抗体在凝胶中直接发生沉淀 反应，在适当位置形成抗原 抗体复合物 ，经染色后， 可对各类免疫球蛋白及其轻
链进行分型
免疫固定电泳
技术要点
先将患者血清或血浆在醋纤膜 或琼脂上作区带电泳，根据血 清蛋白质的电荷不同将其分开， 然后将IgG、IgA、IgM、κ轻 链和λ轻链的抗血清加于分离 的蛋白质泳道，参考泳道则加 蛋白质固定剂，用于区带对照， 作用一定时间后洗去游离蛋白 质，染色后则可见被固定的相
区带电泳双向扩散1将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干2沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽加入相应抗血清进行双向扩散泳23macm051h后槽内加入相应抗血清作双向扩散纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定影响因素抗原抗体比例不当需测抗原抗体最适比抗血清的的抗体谱混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率immunofixationelectrophoresisife免疫电泳原理不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应在适当位置形成抗原抗体复合物经染色后可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型原理区带电泳沉淀反应先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳根据血清蛋白质的电荷不同将其分开然后将iggigaigm轻链和轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道参考泳道则加蛋白质固定剂用于区带对照作用一定时间后洗去游离蛋白质染色后则可见被固定的相应m蛋白成分
免疫扩散技术——IgG测定
注意事项
扩散：
1. 在湿盒中进行。 2. 扩散时琼脂板应保持水平，以免
沉淀环变形，影响结果判定。 3. 若沉淀环不清晰，可用1%鞣酸浸
泡10min后再测量。
测量：
1. 测量沉淀环必须准确，否则会明显影响结果。 2. 当沉淀环不是正圆形时，应量取最大直径和最
小直径后取二者的平均值带入计算。 3. 每批实验均应同步绘制标准曲线。 4. 样品最好做复孔，取直径的平均值带入计算。
实验1: 免疫沉淀凝集技术
抗原-抗体反应
沉淀反应
背景
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验
免疫浊度测定
单向扩散试验 凝胶内沉淀试验
双向扩散试验
凝集反应
直接凝集反应
间接血凝试验
间接凝集反应 胶乳凝集试验
明胶凝集试验
免疫扩散技术——IgG测定
实验原理
单向免疫扩散试验（single immunodiffusion test） • 将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内
• 正常参考值：OD<0.17 • 结果易受多种大分子蛋白质的干扰，特异性差。 • 本试验还受温度变化如离心、洗涤时的温度的影
响很大，重复性差。 • CIC的检出可以为多种与自身免疫相关疾病提供
辅助诊断诊断指标，但由于方法上的问题，其测 定结果尚不能作为诊断疾病的敏感可靠的指标。
实验报告的要求
1. 内容：题目、实验原理、试剂及器材、 实验步骤、实验结果（注明样本编号和 原始数据）、讨论等。
试剂和器材
• RF检测试剂（商品化试剂） • RF阴性血清和阳性血清（试剂盒自带） • 黑色反应板、滴管、搅拌棒等
操作方法
1. 在黑色反应板上取3格，用滴管分 别加待测血清、阳性血清和阴性 血清各1滴，然后每格加入1滴致敏 胶乳颗粒试剂。
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会生活。
2．清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽
有万钧柁，动如绕指柔。”这是在描写 A．电话 C．电报 B．汽车 D．火车 ( )
轮船招商局 正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。
(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是
在列强排挤中艰难求生。
2．航空 (1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始 研制 。 (2)发展： 1918年，北洋政府在交通部下设“ 水上飞机
”；此后十年间，航空事业获得较快发展。
筹办航空事宜
处
三、从驿传到邮政 1．邮政
(1)初办邮政： 1896年成立“大清邮政局”，此后又设
邮传部 邮传正式脱离海关。
，
(2)进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站； 1920年，中国首次参加 万国邮联大会 。
2．电讯 (1)开端：1877年，福建巡抚在 办电报的开端。 (2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪30年代情况才发生变 化。 3．交通通讯变化的影响
依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。
提示：特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车， 近代的小火轮、火车同时使用)。 原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发 展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；
政府及各阶层人士的提倡与推动。
[串点成面· 握全局]
单向免疫扩散试验1
在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局 部向琼脂内自由扩散，在抗原抗体比例合适区域内形 成可见的沉淀环。(抗原抗体反应时，只有其中一种成 分发生扩散） 根据试验形式可分为试管法和平板法两种。
测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的 大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同 时，这种沉淀环与分子量和扩散时间有关。
2.制板
（1）取洁净干燥玻片，置于水平台上
（2）用吸管吸取4ml琼脂（含抗体），于载玻片1/3处 浇注，使琼脂凝胶均匀铺满玻片，不要留有气泡。
3.打孔 待琼脂凝固后，用直径3mm的打孔器打孔， 孔距10～12mm
4.加样
用微量加样器吸取待检血清10μl,加入相应的试验孔中，做 好标记。
将人IgG标准液（30g/L）用生理盐水分别做如下稀释：原 倍， 1:2， 1:5， 1:10， 1:20， 1:30，用微量加样器吸取 稀释标准液10μl,加入相应的试验孔中，做好标记。
台湾 架设第一条电报线，成为中国自
出行 (1)新式交通促进了经济发展，改变了人们的化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便 捷。 (3)促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活
多姿多彩 。
[合作探究· 提认知]
电视剧《闯关东》讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家， 从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山 一家从山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。
一、近代交通业发展的原因、特点及影响 1．原因 (1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促
进中国社会发展。
(2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压
中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。
(3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供 了物质条件。
2．特点 (1)近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和
试剂与器材 1.羊抗人IgG诊断血清 2.人IgG标准液（30g/L） 3.待测人血清 4.琼脂粉 5.生理盐水 6.载玻片(玻璃板）、三角烧瓶、吸管、加样器、打孔器、水 浴箱、湿盒、直尺等
操作方法
1.制备琼脂凝胶 （1）生理盐水配制琼脂凝胶（15g/L），煮沸溶化至澄清，置 56℃水浴中备用。 （2）取适量溶化琼脂，以琼脂∶抗体＝4 ∶1比例吸取相应抗 体，与琼脂充分混合，置56℃水浴中备用。
航空都获得了一定程度的发展。
(2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。 (3)地域之间的发展不平衡。 3．影响 (1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，
一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的
联系，丰富了人们的生活。 (2)消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。
5.扩散
将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内，置 37 ℃ 24h后观察 结果。
历史ⅱ岳麓版第13课交通与通讯 的变化资料
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[自读教材· 填要点] 一、铁路，更多的铁路 1．地位
铁路是
交通运输 建设的重点，便于国计民生，成为国民经济
发展的动脉。 2．出现 1881年，中国自建的第一条铁路——唐山 路建成通车。 1888年，宫廷专用铁路落成。 至胥各庄铁 开平
制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D
三项表述都有错误。 答案：A
二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影 响
(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交
流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快 生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。 (2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得 快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社
1．李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成
为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立
之势”。这说明该企业的创办 A．打破了外商对中国航运业的垄断 B．阻止了外国对中国的经济侵略 C．标志着中国近代化的起步 ( )
D．使李鸿章转变为民族资本家
解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家； 洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业 的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵
3．发展
(1)原因：
①甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的 ②修路成为中国人 (2)成果：1909年 权收归国有。 4．制约因素 政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入 修筑权 。
救亡图存 的强烈愿望。
京张铁路 建成通车；民国以后，各条商路修筑
正轨。
二、水运与航空
1．水运
(1)1872年,