碱性磷酸酶显色剂使用方法

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

使用方法

1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液

2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.

3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应

4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色

干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种

碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

成骨细胞染色方法

以ALP为目标物的检测方法：

1 Gomori钙钴法

【染色原理】

ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】

3%β-甘油磷酸钠5ml

2%巴比妥钠5ml

蒸馏水10ml

2% CaCl2 10ml

2% MgSO4 1ml

【步骤】

（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2偶氮偶联法：

【孵育液配制】

萘酚AS-BI磷酸盐20mg

DMSO 0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml

六偶氮副品红0.5ml

1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）

【步骤】

（1）干细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。

（5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3碱性磷酸酶染色试剂盒法：

【作用原理】干细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】

取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。

【步骤】

（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。

（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。

【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。

针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：

4茜素红法

【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。

（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。

（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。

【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。

5 von Kossa法

【作用原理】

V on Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。

（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。

（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。

（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。

（5）室温下晾干，封固

0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液配方

具体配制方法：

1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中

用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH

待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸）

配好后往里面加0.1g的茜素红

于是0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液就配好了。

茜素红S

中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonate

CAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐；茜素红；（3）茜素磺酸钠；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。

性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。

用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。

配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0．Imol／L的HCI或0 1％的NaOH 调节。