【1】生物样本中蛋白质的提取及测定(分子医学实验)

《分子生物学实验》

实验报告

实验名称：生物样本中蛋白质的提取及测定

姓名：杰

学号：3140104666

组别：

同组同学：唐曦

带教教师：伟俞萍

实验日期：2015年9月15日

目录

1.原理： (3)

1.1生物样本中蛋白质的提取 (3)

1.2生物样本中蛋白质的测定 (3)

1.2.1 Lowry法 (3)

1.2.2 考马斯亮蓝法 (4)

1.2.3 紫外吸收法 (4)

2.操作步骤 (4)

2.1生物样本中蛋白质的提取 (4)

2.2生物样本中蛋白质的测定 (5)

2.2.1 Lowry法 (5)

2.2.2 考马斯亮蓝法 (5)

2.2.3紫外吸收法 (5)

3、实验结果 (6)

3.1 原始数据 (6)

3.1.1 Lowry法 (6)

3.1.2 考马斯亮蓝法 (7)

3.1.3 紫外吸收法 (7)

3.2 数据处理 (8)

3.2.1 Lowry法 (8)

3.2.2 考马斯亮蓝法 (9)

3.2.3 紫外吸收法 (10)

4.讨论： (11)

1.原理：

1.1生物样本中蛋白质的提取

离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。

1.2生物样本中蛋白质的测定

1.2.1 Lowry法

1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色

化合物；1951年Lowry对上述方法进行了改进，让蛋白质先与碱性铜试剂进行反应，然后再与酚试剂反应，改进后的方法可以使反应的灵敏度提高。

蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的紫色或紫红色络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中芳香族氨基酸残基(酪氨酸）的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin-酚试剂形成蓝色复合物。上述呈色反应的颜色深浅在一定围与蛋白质含量成正比。通过与已知含量的标准蛋白质的生色结果进行比较分析，即可检测待测样品的蛋白质含量。目前实验室常规的快速定量测定蛋白质含量方法中，以Lowry等人发展的Folin-酣法应用最为普遍。该方法的优点是:灵敏度高（比紫外吸收法灵敏度高10〜20倍），操作简单快速，不需复杂的仪器设备。

1.2.2 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由掠黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的械性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定围，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈青色，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。

1.2.3 紫外吸收法

蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大pi键，它们在280nm紫外光附近有光吸收，因而使蛋白质在上述紫外光波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。

2.操作步骤

2.1生物样本中蛋白质的提取

1.用颈椎脱白法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，小心去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净。

2.取小鼠肝整个肝组织，在称量纸上剪碎，放入玻璃勾装管中。

3.按1:15的比例往玻璃勾紫管中加入勾装缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液6mL，蛋白酶抑制剂0.16mL)，手动匀浆。注意用力均勾，以免损坏匀浆管。

4.匀浆完成后，取一支2mL eppendorf管，各加入1.8mL勾衆液后，置入冷冻离心中。

5.5.于4℃,13000r/min离心20min后，小心取出上清液0.5ml至2mLeppendorf管中，加入0.5ml缓冲液，用于蛋白质含量的测定，再取出上清液0.5ml至另一2mLeppendorf管中-20℃保存。

2.2生物样本中蛋白质的测定

2.2.1 Lowry法

1.取16mmxl50mm试管16支，标号，放置在试管架上，在1〜6号试管分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0.5mg/ML）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用双蒸水补足至每管总体积0.5mL，在7、8号试管分别加入待测样品25、50uL，并用双蒸水补足至0.5mL(即将待测样品稀释20或10倍）。9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验，取算术平均值作为检测结果。

2.各管加入2.5mL新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，在室温下放置10min。

3.各管加入0.5mL Folin –酚试剂应用液，边加入边立即充分混合（用振荡混合器），然后在室温下放置30〜60min(不要超过60min)。

4.分别用1号和9号管作为空白对照调零，检测其余标准样品管及待测样品管在550nm波长处的吸光度值。

5.根据已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。

2.2.2 考马斯亮蓝法

1. 取16mmx150mm试管16支，标号，放置在试管架上，在1〜6号试管分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取e液用双蒸水稀释至0.5mg/mL)0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用双蒸水补足至每管总体积0.1mL，在7.8号试管分别加入稀释20、10倍的待测样品0.1mL。9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验，取算术平均值作为检测结果。

2.每管加入考马斯亮蓝G—250染料试剂3mL，摇勾，室温静置3min

3.分别用1号和9号管作为空白对照调零，检测其余标准样品管及待测样品管在595nm 处的吸光度值。

4.根据已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。

2.2.3紫外吸收法

1.取16mmx 150mm试管16支，标号，放置在试管架上，在1〜6号试管分别加入标准牛血清白蛋白（2mg/mL)0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用双蒸水补足至每管总体积3mL，在7,8号试管分别加入稀释100,50倍的待测样品3mL。9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验，取算术平均值作为检测结果。

2.分别以1号管和9号管作为空白对照调零，用紫外分光光度计(注意用石英比色杯)于波长280nm处比色，记录各管的吸光度值。

3.根据已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线，然后根据待测样品的