酶联免疫分析法ppt课件
酶联免疫法
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。
根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍.三明治法常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为:1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。
间接法间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为：1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原的含量。
竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法生工121 徐娜酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。
酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。
该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。
酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。
一、医学临床中的应用医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。
1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。
尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。
上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。
2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。
采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。
该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。
3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。
目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。
约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。
酶联免疫分析的基本类型和原理
光度酶联免疫分析法（ELISA）的基本类型及原理1.双抗体夹心法基本原理：①将特异性抗体吸附到固相载体上；②孵育后封板洗涤；③加入含有待测抗原样品，孵育后洗涤；④加入酶标抗体；⑤加入底物显色；⑥测量吸光度。
该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强，成本较高。
2.间接法基本原理：①将特异性抗原与固相载体结合；②洗涤；③加待检样本；④洗涤；⑤加酶标抗抗体；⑥洗涤；⑦加底物显色；⑧测量吸光度。
本法制药更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相对应的抗体。
3.竞争法基本原理：①将特异性抗体与固相载体结合；②洗涤、封板；③加待检样本和酶标抗原混合液；④洗涤；⑤加底物显色；⑥测量吸光度。
4.异种动物双抗体夹心法基本原理：①将第一种动物制备的特异性抗体吸附于固相载体上；②加入待测样品；③孵育后洗涤；④加入第二种动物制备的特异性抗体；⑤孵育后洗涤；⑥加入酶标抗体；⑦孵育后洗涤；⑧加入底物显色；⑨测量吸光度。
此法可以用通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。
5.竞争抑制法基本原理：①制备抗体包被的固相、酶标记物和纯化抗原；②待测样本中无特异性抗体时，通过固相抗体-抗原-酶标抗体的反应顺序使底物显色；③待测样本中有特异性抗体时，它和加入的抗原结合，使最终结合到固相上的酶标抗体减少，酶活性减少50%以上便是抑制试验阳性，判定待测标本中有特异性抗体。
6.双夹心法原理:①用抗人IgM包被固相载体②封板洗涤；③加入底物反应。
该法可以排除IgG类抗体的干扰，并避免类风湿因子对检测的影响。
7.抗酶抗体法①基本原理：②用抗原包被固相载体；③孵育后洗涤；④加入待测样本；⑤孵育；⑥加入第二抗体，发生第二次抗原抗体反应；⑦加入抗酶抗体，发生第三次抗原抗体反应；⑧加入酶，发生第四次抗原抗体反应；⑨加入底物显色；⑩测量吸光度。
8.抗原直接包被法原理：①将待测抗原直接包被到固相载体上；②孵育后洗涤；③加入酶标抗体；④孵育后洗涤；⑤加入底物显色；⑥测量吸光度。
四环素类药物检测(酶联免疫法).
样品制备与贮存
1. 试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的实验室样品，在密
闭的情况下，置于不超过60℃的水浴中温热、振荡，待样品全部融化后
搅匀，冷却至室温，分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中， 密封，并加以标识。
2 . 试样的保存
将样品于室温下保存
测定步骤
1. 提取 称取 1g 试样，精确到 0.01g ，置于 50mL 具塞试管中，加入 10mL 磷酸盐缓 冲溶液于液体混匀器上快速混匀1min，使试样完全溶解。再加入39mL磷 酸缓冲溶液后，将试管置于超声波水浴中超声5min，取出摇匀，用注射
过滤器将适量的样品溶液过滤至10mL具塞试管中，供酶标仪测定，此溶
液稀释系数为50。
测定步骤
2. 测定条件 以下所有操作应20℃-24℃室温下进行。 （1）酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450nm。 （2）人工洗版条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250mL。
（ 3 ）四环素族试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（ 20℃-24℃）后
仪器和设备
1. 酶标仪
2. 8道移液器：50μ L-300uL。 3. 单道移液器：5uL-50uL,100μ L -1000μ L和2mL-10mL。 4．液体混匀器。 5．超声波水浴。
6．注射过滤器：2 mL-5mL，并带有孔径为0.45μ m的水相针头式过滤膜。
7．具塞试管：10mL，50mL。 8．pH计：测量精度兽药残留检测
原理
试样中残留的四环素族抗生素与微孔板中结合的四环素抗生素共同 竞争四环素族抗生素抗体，在酶标记物的作用下，形成的酶标记抗原抗 体复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出 试样中四环素族抗生素的含量。
酶联免疫分析技术
室 温 温 育 的 反 应 ， 操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在 规 定 的 范围 内 ， 标准 室 温温 度 是指 20-25℃ ， 应注 意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯 作 为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处 有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物（磷酸 4- 甲基伞酮），可用 于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的 比色法。
洗涤液
常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20磷酸盐缓冲液。
异相法：
?Ab* A* *g*和Ab 分离，然后测定 Ab Ag 或Ab 的量， 从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
*
Ab *
Ab A g
均相法 ：
?Ab *Ag中的标记物 *失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
* Ab *
Ab A g
1 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。
2013-8-13
免疫检验
? 利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等）
? 利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。
酶联免疫分析技术
免疫分析法ppt
酶联免疫分析法——应用2
2、放射免疫分析法(RIA)
• 简介
1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核 素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA)。
• 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫
化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种 超微量物质的测定方法。
兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高
效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相 色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射 电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电 泳－离子阱质谱等方法。
二、免疫分析法
免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。
特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。
免疫分析法ppt
兴奋剂的检测方法
之免疫分析法
一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法
（1）酶联免疫分析法 （2）放射64年，国际运动医学会的国际兴奋剂 会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的 运动员使用任何异体物质，或以不正常的 量和不正常的进入机体的途径使用生理物 质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛 成绩的行为。
抽干。
4、结果
γ一记数 仪记数， 并自动计 算尿中MA
浓度 (ng·ml-1)
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检 测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术 (RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的 特异性，更兼有发光反应的高敏感。
1、酶联免疫分析法(ELISA)
酶联免疫分析法——原理
安培酶联免疫分析法
在HPLC中流动相的选择非常重要，一方面它起载体作用，将酶催化反应的产物同样品中的其他物质如未反应的底物、蛋白质等进行分离：另一方面它还要作为电化学检测的支持电解质起导电作用，所以一般选择用导电性溶液作为流动相。一般反相色谱的流动相具有有极性，可用于电化学检测器，而正相色谱可以通过加电解液后柱、采用大体积的壁喷式检测器等方法来改善电化学检测器的适应性。另外在待测物质的氧化还原反应中常常会消耗或产生质子，因此在实验中控制流动相的pH也是十分重要的。一般来说缓冲液的浓度在0.01~0.1mol/L，其组成和pH的选择要根据待测物质的实际情况加以确定。溶剂和电解质的纯度越高，背景和噪声电流越低。
化学修饰电极也可用于HPLC的安培检测。如在玻碳电极表面镀上一层带电聚合物膜，如聚4-乙烯基吡啶或阳离子交换剂Nafion,就可以有效改善电极对相反电性被测物的分析性能。
工作电位的选择
在检测过程中工作电极电位的选择非常重要，电位较高时，待测物质反应完全，但背景电位大、噪声大选择性不好，对检测限有影响，而且工作电位与被测物质的电化学性质和流动相的组成有很大的关系。工作电位的选择可以通过循环伏安法确定，方法是将待测物质
与流动相组成的混合溶液模拟电化学检测器中的流出液，在常规电解池中用循环伏安实验来了解待测物质的电化学信息，此法较为简单。另一种准确的方法是流体动力学伏安法，它常用于安培检测器工作电位的选择，方法是在不同的电位下将被测物质的溶液重复的注入HPLC，同时用检测器记录相应的电流，得到不同电位下的电流曲线，一般是一个阶梯形的伏安图，每种物质都具有特定的半波电位和极限电流。通常工作电位选择在阶梯波的平台位置，这样被测物质可以完全反应，有效提高反应的灵敏度。
安培法中最简单、最常用的模式是在恒定的电位下测定待测物质的氧化还原电流，这种恒电位测量模式可以避免双电层充电和表面瞬变效应，因而信噪比高，可以达到很低的测定下限，还可以根据需要改变电位的各种参数，采用不同的电位脉冲检测模式如示差脉冲安培法、反向脉冲安培法、三脉冲安培法，或是采用双电极或多电极检测模式，以达到检测低浓度样品的要求。
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
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CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
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抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
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检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫法在农药残留分析中的应用PPT课件
酶联免疫法的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，酶联免疫分析将逐渐实现自动化和智能化，提 高检测效率。
高灵敏度与高特异性
通过改进抗体质量和优化实验条件，提高酶联免疫法的灵敏度和特 异性。
多残留检测
发展多残留检测技术，实现对多种农药残留的同时检测。
酶联免疫法在农药残留分析中的未来发展方向
现场快速检测
开发便携式酶联免疫分析设备，满足现场快速检测的需求。
生物传感器技术结合
将酶联免疫法与生物传感器技术结合，提高检测的实时性和灵敏 度。
生物信息学应用
利用生物信息学技术对酶联免疫数据进行处理和分析，挖掘更多 有价值的信息。
提高酶联免疫法的灵敏度和特异性的方法
优化抗体质量
01
筛选高亲和力和高特异性的抗体，提高检测的灵敏度和特异性。
敏度较高。
特异性好
酶联免疫法利用抗体与 抗原的特异性结合，能 够准确地检测出目标农
药残留。
操作简便
酶联免疫法的操作相对 简单，所需设备较少，
适合现场快速检测。
成本较低
酶联免疫法的试剂成本 相对较低，检测成本较
低。
酶联免疫法在农药残留检测中的局限性
交叉反应
酶联免疫法可能会与其他结构类似的 农药产生交叉反应，影响检测结果的 准确性。
慢性危害
长期摄入低剂量的农药残留可能对 人体的多个系统产生慢性危害，如 神经系统损伤、免疫系统异常、生 殖系统毒性等。
致癌风险
部分农药残留被认为具有致癌性， 长期接触可能增加患癌症的风险。
农药残留对环境的危害
01
02
03
生态破坏
农药残留进入土壤和水体 后，可能对土壤生物和水 生生物造成毒害，破坏生 态平衡。
酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述
• 抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 • 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋 白都是抗体。 • 例如无免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不 是抗体，尽管其结构与抗体相似。 • 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中 也有存在。 • 抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得 抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具 有高特异性（即专一性）和可逆性。
第一节 酶联免疫分析概述
• “免疫（immunity）”一词源于 “immunitas”，原 意是免除税赋和差役。 • 研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。 • 20世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物 的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、 免疫学检测、医学免疫学等多个分支。 • 现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“ 异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和 ，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。
第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标记免疫分析法及常用标记酶 放射免疫分析法 1、免疫析法分类
化学发光免疫分析法 标记免 疫分析 免疫 分析 电化学免疫分析法 荧光免疫分析法 竞争性酶联免疫分析 酶联免疫 分析法 非竞争性酶联免疫分析 均相酶联免疫分析 非均相酶联免疫分析 非标记免疫 分析 沉淀反应、凝集反应、 免疫电泳、免疫扩散
第一节 酶联免疫分析概述
2、抗原、抗体与免疫反应 • 抗原是能够引起免疫反应的分子。 • 免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产 生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 • 具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。 • 免 疫 反 应 原 性 （ immunoreactivity ） 或 抗 原 性 （ antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合，引起免疫反应的性能。 • 具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反 应性的物质被称为半抗原（hapten）。
酶联免疫分析法
②用已知抗体检测未知抗原； ③定性或定量检测体内多种大分子物质； ④用已知抗体检测某些药物、激素等多种半抗原物质。
第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标识免疫分析法及常用标识酶 1、免疫分析法分类
第一节 酶联免疫分析概述
白都是抗体。 • 例如无免疫活性旳免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不
是抗体，尽管其构造与抗体相同。 • 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中
也有存在。 • 抗原抗体分子之间存在着构造互补性和亲和性，使得
抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具 有高特异性（即专一性）和可逆性。
第一节 酶联免疫分析概述
• Gal催化β-D-半乳糖苷水解反应旳最适pH为7.5，转 化效率很高，且比HRP易于标识，背景值低，稳定性 好。
• Gal比活力应不少于30U/mg，5℃能保存1～2年。
第二节 酶联免疫吸附分析法
一、光度酶联免疫分析 1 、 酶 联 免 疫 吸 附 分 析 （ enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA）原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同旳环
值也略高。 • ELISA载体旳形式有小试管、小珠和微量反应板。
第二节 酶联免疫吸附分析法
3、固相载体旳包被与封闭 （1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体
上旳过程。 • 以聚苯乙烯微量反应板为例，一般先将抗原或抗体溶
于pH 9.6旳碳酸盐缓冲液（或pH 7.2旳磷酸盐缓冲 液，pH 7～8旳Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔， 置4℃过夜，洗涤即可。 • 包被浓度随载体和包被物旳性质可有很大旳变化，每 批材料需经过试验与酶结合物旳浓度协调选定。 • 一般蛋白质旳包被浓度为0.1～20µg/ml。
免疫酶联法
免疫酶联法
免疫酶联法是一种常用的生物化学分析技术，用于检测生物体内某些特定蛋白质或者其他生物分子的含量、浓度、活性等参数。
免疫酶联法的基本原理是利用特异性抗体与待测物相互结合，然后加入特定的酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物，最后加入底物进行反应，观察酶反应产生的色素变化或荧光信号的强度，从而计算出待测物的含量、浓度、活性等参数。
免疫酶联法具有高灵敏度、高特异性、操作简便等优点，已经广泛应用于生物医学研究、临床检测、食品安全监测、环境污染检测等领域，成为现代生物医学研究和检测的重要技术手段之一。
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苹果酸脱氢酶
猪心线粒体
无机焦磷酸酶
大肠杆菌
荧光素酶 丙酮酸激酶
发光生物 酶联免疫分哺析法乳动物组织
EC编号 1.11.1.7 3.1.3.2 3.1.3.1 3.2.1.23 1.1.3.4 3.5.1.5 3.5.2.6 1.11.1.6 3.2.1.3 4.2.1.1 3.1.1.7 1.1.1.49 3.2.1.17 1.1.1.49 3.6.1.1 1.3.12.7 2.7.1.40 14
偶联后仍保持较高的催化活性； ③使用稳定性和保存稳定性好； ④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速； ⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶；
酶联免疫分析法
11
第一节 酶联免疫分析概述
⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生 反应的干扰物质；
⑦酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉； ⑧均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗
• 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中 也有存在。
• 抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使逆性。
酶联免疫分析法
7
第一节 酶联免疫分析概述
• 抗原、抗体发生如下免疫反应：
• Ag+Ab Ag-Ab
• 该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学 基本原理，其反应式为
• 具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反 应性的物质被称为半抗原（hapten）。
酶联免疫分析法
6
第一节 酶联免疫分析概述
• 抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
• 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋 白都是抗体。
• 例如无免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不 是抗体，尽管其结构与抗体相似。
原-酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
（2）酶的评价指标 通常用RZ和酶的比活力评价标记 酶的质量。
• RZ表示酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的 比值。
• 酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每1ml酶液 所具有的酶活性单位数。
（3）酶联免疫分析中的常用酶 下表列出了酶联免疫分 析中的常用酶。其中EC编号是根据国际酶学委员会的 规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。
第七章 酶联免疫分析法
酶联免疫分析法
1
第七章 酶联免疫分析法
• 基本要求：
• 了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的
原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析
法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固
相载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止
液及ELISA法常用酶的底物系统，掌握ELISA的酶联
，原意是免除税赋和差役。 • 研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。 • 20世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物
的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、 免疫学检测、医学免疫学等多个分支。 • 现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“ 异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和 ，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标记免疫分析法及常用标记酶 1、免疫分析法分类
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
2、酶标记免疫分析法中使用的酶 （1）酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件： ①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强； ②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
酶联免疫分析常用酶
酶
来源
辣根过氧化物酶
辣根
酸性磷酸酶
动植物
碱性磷酸酶
牛肠
β-D-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶
大肠杆菌 曲霉菌
脲酶 青霉素酶 过氧化氢酶
Jack豆
— 肝
葡萄糖淀粉酶
根霉菌
碳酸苷酶
牛红细胞
乙酰胆碱酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
溶菌酶
— 肠系膜明串细菌
鸡卵白
方法和试验方法，熟悉ELISA反应条件的选择，掌握
ELISA的定量计算，了解ELISA的灵敏度提高途径，
熟悉ELISA放大系统。了解化学发光分析的原理，熟
悉化学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常
用的标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分
析常用的生物发光反应酶联体免疫系分析。法
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第七章 酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述 第二节 光度酶联免疫分析 第三节 发光酶联免疫分析
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
一、免疫分析
1、免疫分析发展史
• 免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待测物质（ 抗原或抗体）与其相对应物质（抗体或抗原）之间专 一特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。
[Ab-Ag] k1 K [Ab][Ag]k2
• 式中：[Ab]为游离的抗体结合位点的浓度；[Ag]为游 离的抗原结合位点的浓度；[Ab-Ag]为抗原-抗体复
合物的浓度；k1为正反应速率常数；k2为负反应速率
常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
• 这种抗原-抗体反应既可发生于体内（in vivo），也 可发生于体外（in vitro）。
• 免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选择性化学 试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。
• 宋代 人工痘苗预防烈性传染病天花
• 1971年 第一届国际免疫学会议 将免疫学与微生物学 分开发展成一门独立的学科。
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
• “免疫（immunity）”一词源于 “immunitas”
酶联免疫分析法
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第一节 酶联免疫分析概述
2、抗原、抗体与免疫反应
• 抗原是能够引起免疫反应的分子。
• 免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统 产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。
• 具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。
• 免 疫 反 应 原 性 （ immunoreactivity ） 或 抗 原 性 （ antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合，引起免疫反应的性能。
• 抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采 用血清做试验，所以体外抗原-抗体反应也称为血清 学反应（serologic reaction）。
• 基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用于以下几个 方面：①用已知抗原检测未知抗体；
②用已知抗体检测未知抗原；
③定性或定量检测体内各种大分子物质；
④用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。