生物光子学5-05

SHG只发生在非对称介质中；
SHG信号是泵浦波长的一半，并很容易从泵浦光和荧 光中区分开；
SHG显微可用于非荧光样品和组织。
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5.10 非线性光学成像技术
SHG vs.双光子荧光
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5.10 非线性光学成像技术
二次谐波与双光子荧光不同： 1）二次谐波产生不需要光吸收、不存在热损伤和光漂 白（如果激发光位于组织吸收带以外）； 2）只有非对称性组织才能产生二次谐波； 3）二次谐波波长是准确的激发波长的1/2，而双光子荧 光是宽的荧光谱； 4）二次谐波不需要荧光标记物标记。
( 3 )
相干反斯托克斯（ CARS ）是一种光学非线性频率转换的 过程。当两束输入光的频率差 v1-v2 和分子的拉曼动态振动 频率一致时，两个频率分别为 v1 和 v2 的输入光会产生频率 为2v1-v2的输出光。 20
5.10 非线性光学成像技术
相干反斯托克斯拉曼散射是一种类似于激光的相干辐射过程，是由于 介质分子振动状态的锁定而产生的。所谓振动状态的锁定是指频率为v1 和v2的两束相干光共同作用于介质，而使介质分子振动状态的位相之间 有确定的关系，辐射的激光束有确定的方向，而且必须满足相位匹配 条件才能产生的。 利用CARS光谱进行显微成像即是CARS显微成像。
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5.10 非线性光学成像技术
1、谐波成像
二次谐波是二阶非线性光学过程，利用波长为λ（频率 为v）激光激发非中心对称生物组织，产生波长为λ/2（ 频率为2v）的二次谐波。
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5.10 非线性光学成像技术
• SHG的特点：
光源的光谱（近红外到红外）在样品的吸收谱（蓝紫 光）之外，样品没有热损伤或光致漂白；
5.10 非线性光学成像技术
无毛小鼠耳朵图像，平均速度2秒/幅。 表征脂CH2对称拉伸振动的拉曼位 移在 2,845 cm-1 。 (A) Stratum corneum with bright signals from the lamellar lipid intercellular space that surrounds the polygonal corneocytes. Bright punctuated dots are ducts of sebaceous glands. (B) Sebaceous glands at ≈30μm from skin surface. (C) Individual cells of the gland compartment can be recognized, with nuclei visible as dark holes (arrow). (D) Adipocytes of the dermis at ≈ 60μm from skin surface. (E) Adipocytes of the subcutaneous layer at a depth of ≈ 100μm.
... ... ...
荧光团的光致漂白损伤 毒性
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5.10 非线性光学成像技术
1930年诺贝尔物理奖
拉曼散射
优点 基于分子固有的 振动或转动；能 够反映分子所有 振动信息；对样 品无需标记
缺点
信号弱，平均入射 105个光子才能产生1 个拉曼光子；采集信 号时间长；激发光功 率高。
C. V. Raman
C. L. Evans, et al，“Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti25 Stokes Raman scattering microscopy”，PNAS， 2005, Vol. 102
5.10 非线性光学成像技术
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5.10 非线性光学成像技术
• 二次谐波 (Second Harmonic Generation, SHG)显微 • 三次谐波 (Third Harmonic Generation, THG)显微 • 相干反斯托克斯拉曼散射 (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS)显微 • 多光子激发荧光显微
利用CARS显微成像研 究鱼油对脂代谢的影响
X. Sunney Xie, Ji Yu, Wei Yuan Yang. Living Cells as Test Tubes. SCIENCE, 2006，Vol. 312
(A) Raman spectra of EPA and deuterated OA. (B to F) Live liver cells were treated with 0.4 mM EPA and 0.2 mM deuterated OA for 7.5 hours and labeled with monodansylcadaverine, a dye for staining degradative organelles. (B) CARS image tuned to –CD2 (blue, deuterated OA). (C) CARS image tuned to –CH2 (red, EPA). (D) Composite image of wellmixed –CO2 and –CH2 (purple) and two-photon fluorescence from monodansylcadaverine (green). [(E) and (F)] Zoomed-in 26 by regions in the cell where triglycerides rich in –CH2 and –CD2 are colocalized within degradative compartments (stained monodansylcadaverine and indicated by arrows).
主讲人：刘立新
lxliu@xidian.edu.cn 西安电子科技大学
第5章
生物光子学成像技术
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本章内容
5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势
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5.10 非线性光学成像技术
• THG的优点：
– THG是物质固有的物理效应，是一种光和物质相互作用的多光子过 程（但与三光子吸收不同，不包含介质对光的吸收）；
– THG没有对称性要求，可以在表面及大块组织内产生；
– 空间分辨率高，无需标记、没有光漂白，不会导致细胞的生理变化 及细胞死亡；
– 信号蓝移，容易与激发光分离，信噪比高，容易与自体荧光分离； – 具有单层敏感性（可用于对单分子薄膜的构象性研究）。
J.-X. Cheng, Y. K. Jia, et al. Laser-Scanning Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy and Applications to Cell Biology. Biophysical Journal, 2002, Vol. 83, 50224 509
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50μm
胃高分化腺癌
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胃平滑肌
通过光谱分辨同时获得样品的自体荧光谱分布和二次谐波。右边五幅图像中第一幅为二 次谐波成像，二、三幅表示不同波段自体荧光图像，第四幅为荧光图像，最后一幅为全 14 部光谱(包括二次谐波和荧光)叠加图像。
5.10 非线性光学成像技术
双光子荧光(红色，左)和三次谐波（右）
(1888-1970)
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5.10 非线性光学成像技术
拉曼散射
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5.10 非线性光学成像技术

相干反斯托克斯拉曼散射
I n p u t b e a m E ( ) E ( ) E ( )

N e w o u t p u t b e E ( 2 )
m e d i u m
缺点：
–
需要高的峰值功率，高能脉冲辐照有损伤样品的风险。
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5.10 非线性光学成像技术
谐波实验装置示意图
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5.10 非线性光学成像技术
组织成份中的胶原、微管蛋白、纤维素纤维等是Swk.baidu.comG信号的主要来源。
右图：老鼠尾腱（将肌肉 连接在其骨骼关节处的粗 硬的无弹性的纤维状组织 束）的SHG显微图像
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5.10 非线性光学成像技术
2、CARS显微成像 • 背景
• 发展现状 • 应用
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5.10 非线性光学成像技术
高时间和空 间分辨率 高 灵 敏 度
现代生命 科学研究 手段
荧光染料标记技术
高化 学特 异性
实时三维 显微成像
...
荧光技术的缺陷
自体荧光信号弱
外源标记的影响
非侵入光谱和显微成像技术 拉曼散射
CARS信号的特点:
无需标记，非侵入式探测； 波长蓝移，频率较高，能够在较强的荧光背景条件下检测到； 信号强度大、方向性好，具有高的灵敏度； 高空间分辨率和三维层析能力，横向分辨率高于0.5μm，纵向分 辨率高于0.75μm。
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5.10 非线性光学成像技术
近年来，研究人员对CARS光谱分析和显微成像技术在理论 和实验方面进行了系统的研究工作，特别是美国哈佛大学谢 晓亮，美国普渡大学程继新课题组，打开了单键CARS显微 成像技术进入生物、医学研究领域的大门。 Zumbusch等首次实现了对活细胞进行 了高质量的CARS层析成像； M. D. Duncan 等首次实现了CARS显微 成像； Begley、Harvey和Byer首先提出了 CARS光谱研究技术的设想；
1999 1999
1982 1982
1974 1974
1965
Maker和Terhune首次发现了相干 反斯托克斯拉曼散射（CARS）；
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5.10 非线性光学成像技术
CARS显微成像技术 的典型光路配置
（a）前向探测CARS（FCARS）光路； （b）前向探测偏振CARS （P-CARS）光路； （c）背向探测CARS（ECARS）光路； （d）相对传输激发CARS （C-CARS）光路。
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5.10 非线性光学成像技术
间歇期NIH 3T3 cells的F-CARS, E-CARS, and DIC 成像 C-H stretching vibrational frequency：2870 cm-1. The pump frequency was 14054 cm-1 and the Stokes frequency was 11,184 cm-1.
5.10 非线性光学成像技术
• 利用CARS成像对活细胞内细胞器运动进行动态监测
前70秒不动或小范围内动，接下来40秒与马达蛋白相连，移动8m，Scale 27 bar:2m
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τ
窄带通 滤光片
光隔离器 钛宝石飞 秒激光器
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5.10 非线性光学成像技术
人体皮肤胶原束的非线性三维成像（SHG、AUTOfl），激发波长880 nm, 垂 直和水平偏振，带通滤光片：440/20 (SHG)和515/30 (autofluorescence)，标 13 尺：Bar = 20 µ m.
5.10 非线性光学成像技术
荧光多参量和二次谐波复合成像
(F) 2D projection of 60 depth-resolved slices separated by 2μm. Panels to the right and under F show the yz and xz cross sections taken at the white lines, respectively.
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5.10 非线性光学成像技术

三次谐波产生
E ( ) E ( ) E ( )

m e d i u m
( 3 )
E ( 3 )
THG 是三阶非线性过程，与光强立方成正比，频率为 v 的 输入光束会产生频率为 3v的新的光束，同样也是非共振的 过程（在此过程中介质既不吸收能量，也不发射能量）； 三阶效应对物质没有对称要求的限制。