代谢组学分析技术的新进展

系统生物学的飞速发展促使科学研究体系发生了巨大

变化，研究理念从以往的“个体论”过渡到当今的“整体论”。而各种“组学”的研究也应运而生，代谢组学即是其中一个重要分支。代谢物是细胞生理活动的最终产物。当细胞所处环境发生变化，如遗传信息改变、毒物药物作用、细菌病毒侵入等时，均会使细胞产生的内源性生物小分子发生相应变化，而代谢组学就是通过研究这些小分子物质来推断生物系统对基因或环境变化而产生的最终应答[1-4]。代谢组学作为一门新兴学科，已广泛应用于毒理学研究、药物研发、疾病的诊断和治疗等方面。与此同时，代谢组学的分析技术也随着研究的深入而不断发展。

代谢组学的概念

早在1983年，Nicholson等[5]首先应用核磁共振氢谱（1H NMR）来检测血浆、血清中的小分子代谢物。而直到1999年，Nicholson等[6]才正式将代谢组学定义为，以动物的体液和组织为研究对象，研究生物体对病理生理刺激或基因修饰产生的代谢物质其质和量的动态变化，关注的对象为相对分子质量在1000以下的小分子化合物。2000年，Fiehn等[7]正式提出“代谢组学（metabolomics）”这个名词。

Fiehn[3]将生物体系的代谢产物分析分为4个层次。

①代谢物靶标分析：可对代谢物组中某一个特定的组分进行分析，主要用于筛选和要求高灵敏度物质的分析。②代谢物谱分析：可对一种特定的代谢物进行分析，如碳水化合物、氨基酸等，主要在药物研究中描述特定化学药品分解代谢途径[8]。代谢物谱这个概念目前应用已十分广泛，甚至已代替原有的“代谢组学”概念[9]。③代谢物组分析：可在限定条件下对特定生物样品中所有代谢物组分进行定性和定量分析。代谢物组包括细胞内代谢物及细胞外液代谢物，必须要有严格的样品制备和分析技术。④代谢物指纹分析：细胞产生的代谢物通过核磁共振（NMR）或质谱（MS）分析，得到的光谱就是这个代谢物的“指纹”。这种分析方法不分离鉴定具体单一组分，只是对样品进行快速分类。

代谢组学相关技术及进展

代谢组学研究过程包括3个步骤，即样品的制备、代谢物的分离和检测、数据分析及模型的建立[10]。

一、代谢组学的研究样品

因尿液、血清或血浆包含上百种待测物质，获取途径也较方便，已成为目前代谢组学研究中最常用的样本[11]，其他如脑脊液、胆汁、消化液、唾液、精液、羊水等，亦可作为代谢组学研究的样本。

血液样本反映机体对病理或生理刺激的瞬时信息，评价机体的动态平衡。尿液标本常包含一段时间内产生的代谢信息，反映机体当前的生理或病理状态、生物学年龄，也可预测各种先天不足或外环境影响的致病率。组织包含的代谢物可帮助判断该组织所属器官发生生物学进程改变后所产生的分子信息，因此可用来解释机体如何对刺激作出生化应答[11]。

当然，因为样本的制备过程及获取途径不同，选取不同样本，得到的数据会有相应差异。如在血制品中，血浆和血清都可作为代谢组学的研究样本。Liu等[12]通过气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）方法分别检测血清和血浆中的代谢物谱，发现在血清或血浆的准备过程中，血液的待检时间会影响代谢物的峰面积。这对血浆的影响更大，等待时间越长，血清中某些代谢物含量会显著增高，而血浆中则大大减少，故认为血清更适合作为代谢组学的研究样本。

样品存储也是代谢组学研究中一个重要的环节，主要目的就是尽可能保留最原始的代谢信息，避免实验误差。最佳保存方式是液氮或－80℃的低温冰箱。

二、代谢产物分析技术

NMR光谱技术和MS技术是目前最常用的2种代谢组学分析方法。

1．NMR光谱：NMR技术是最早被用于代谢组学研究的技术之一[5]，其利用原子核在磁场中的能量变化来获得相关核信息。目前常用的有1H-NMR、碳谱（13C-NMR）和磷谱（31P-NMR），其中以1H-NMR应用最为广泛[13]。

NMR技术几乎不需要进行样品前处理，可快速对样本进行分析，即使样本量极少，也可获得大量信息[14]。NMR为非侵入性操作，不破坏样本，是现有代谢组学分析技术中唯一能用于活体和原位研究的技术。同时利用NMR弛豫特性

·综述·

代谢组学分析技术的新进展

邱青青，燕敏，李琛

（上海交通大学医学院附属瑞金医院外科，上海200025）关键词：代谢组学；分析技术；核磁共振氢谱

中图分类号：R364.2文献标识码：C文章编号：1671-2870（2011）01-0082-04

基金项目：上海市自然科学基金（10411967000）

通讯作者：李琛E-mail:leechendoc@

和代谢物弥散的差异，可通过代谢物谱编辑技术，在不分离样本的条件下分离不同信号[15]。NMR技术可对一个样本中所有代谢物进行相同灵敏度的检测，即能对生物样品进行动态检测。基于上述优势，NMR被广泛地应用于疾病诊断和治疗[16-17]、药物研发[13]、营养和毒理等领域。

NMR技术最大的不足在于灵敏度低。因其检测过程中省略了前期分离的步骤，故检测样本中包含了一部分电噪声和化学干扰。近年来，对于这个问题，也有人提出通过降低样本中的电噪声和化学干扰以改进样本的信噪比，来提升NMR的灵敏度[1]。

与此同时，NMR技术本身也在不断发展[9]。针对不同的样品及检测方式，目前常用的有活体定域MR谱、原位活体组织萃取液的高分辨1H NMR谱、原位活体组织的高分辨魔角旋转1H NMR谱（high resolution-magic angle spinning1H NMR spectroscopy of intact tissue biopsy samples,HR-MAS1H NMR）和生物体液的立体高分辨1H NMR谱等。随着这些技术的应用，大大拓展了代谢组学的实际应用，尤其适用于肿瘤的早期诊断和预后检测[18]。Yang等[19]应用HR-MAS1H NMR技术对人肝细胞性肝癌进行检测，发现肿瘤组织与邻近正常组织的代谢物有显著差异，肿瘤组织中乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、胱氨酸、胆碱代谢物、磷酸乙醇胺等水平都明显升高，而三酰甘油、葡萄糖、糖原等水平明显下降。同样，在非肝硬化组织、肝硬化组织及低分化肿瘤组织的代谢物也各有不同。

2．MS：MS是一种与光谱并列的谱学方法，基本原理是将样品中各组分电离成离子束，进入质量分析器聚集而得到MS图谱，以确定其质量。MS与NMR相比，其优势在于灵敏度高、分辨率高及特异性强[20]，但对样品处理的要求较高，因此需联合色谱技术对样品进行前期分离。根据样本的性质及待检代谢物的不同，通常采用液相色谱（liquid chromatography，LC）和气相色谱（gas chromatography，GC）及毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)。

（1）GC-MS联用：GC技术是以气体作为流动相的色谱法，常用于分离挥发性化合物，其分离效率高、样品用量少、检测灵敏度高、选择性好、应用范围广，常与MS联用，广泛应用于代谢组学的研究领域，如代谢物谱的分析[21]。

（2）LC-MS联用：LC技术是以液体作为流动相的色谱法，适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。GC不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性，LC可弥补这一不足。LC中，现广泛应用的有高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法，其是在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果；还有超高效液相色谱法(ultra-performance liquid chromatography，UPLC)，可使其分离效率、峰容量及灵敏度明显提高[20]。

（3）CE-MS联用：CE是以毛细管为分离通道，在高压直流电场的驱动下，样品的各种离子开始迁移，根据离子的迁移速度、电荷及颗粒大小对样本中各组分进行分离，是目前最有效的分离技术。CE技术可同时检测多种样品，其所需样品量少、分析速度快、分离效率高、应用范围广等特点[22]使CE-MS在近年来的代谢组学研究中越来越得到重视[23-24]。

但常用的色谱质谱联用技术无疑都需对样本进行前期处理，而样本经过分离可能降低信息通量，甚至导致样品的降解、变质或污染，使检测精度受到影响[25]。

MS技术也在不断发展，除了简化样本的分离过程，还为满足越来越大的信息需求而创造不同的分析平台。气压电离傅里叶变换质谱（atmospheric pressure ionization Fourier transform mass spectrometry,FT-MS）就是近几年比较流行的一种用于代谢组学研究的质谱技术。FT-MS是基于离子在一个均匀磁场中的回旋运动，当离子的回旋频率与激发频率发生共振时，离子将加速至一个较大的半径回旋，从而产生可被接受的电流信号。所检测到的信号再经傅里叶变换处理，转变为我们所需的质谱图。FT-MS技术的应用无需样品分离步骤[14]；同时，其具有超高的分辨率，检测误差仅为百万分之一甚至更小[26]。Han等[27]同时采用FT-MS与LC-MS检测人血浆中的胆碱含量，发现应用FT-MS检测单一样本仅用时3min，且只需原样本量的1/500。

基于表面质量分析也越来越得到关注，其中基质辅助激光解析飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是最主要的一种分析技术。基质辅助激光解析电离（MALDI）的原理是通过激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质吸收激光能量后均匀地传递给生物分子，使其离子化；目的是保护生物分子不会因为过强的激光能量导致生物样本被破坏，因此是一种软电离方式。再根据离子加速后到达检测器的飞行时间（TOF）的不同而被检测得到峰谱。该技术适用于混合物及生物大分子的测定，具有高质量范围、高灵敏度、高准确率、高分辨率及大信息量等特点[28]。Seng等[29]认为，这项革命性技术相较传统分子诊断技术能更方便、快捷地进行病原学诊断。然而，基质结晶大小限制了组织成像的空间分辨率，阻碍了这项技术的进一步发展。因此，新型的非基质辅助质谱技术逐渐开展，如二次离子质谱（SIMS）、解析电离质谱（desorption electrospray ionization，DESI）、激光消融电离质谱（LAESI）、硅表面解析电离质谱（DIOS）等。

近年来，一种新型技术——

—纳米起始物质谱（nanostruc-ture-initiator mass spectrometry，NIMS）技术崭露头角。这是一种无需基质辅助的解析电离技术，更适用于小分子物质的检测[25]，其是在DIOS的基础上发展而来的，选用多孔硅作为起始物，当硅表面吸收激光后，产生热量并汽化，使样品发生解析电离。因无需基质辅助，NIMS几乎没有化学干扰，对样本质量的要求也极低。NIMS无需样本前期准备，大大缩短了MS检测技术的步骤，为生物组织、体液的复合物提供一种快速、简便、灵敏的检测手段[30]。

3．NMR与MS联用：NMR与MS技术各有利弊。如能联合2种研究，结果彼此互补，可能得到更多信息。2000年，Lindon等[31]提出，在药物研发中联合HPLC-NMR-MS技术来进行研究。Atherton等[32]应用不同分析方法发现的生物标志物不尽相同，可以对同一研究目标联合多种研究手段进行