8-目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
高三生物一轮复习PCR知识总结
高考生物PCR的过程及应用考点归纳总结一、基础考点1.名称：多聚酶链式反应2.原理：DNA双链复制（DNA的半保留复制）、DNA的热变性原理3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列4.过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸再耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的DNA链④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过程。
5.PCR反应体系的成分及作用DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA原料∶dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量酶∶Taq聚合酶（热稳定DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）引物∶一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（注意：引物与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补）Mg2+：维持酶活性所必需PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶6.DNA在体内复制的条件模板∶DNA分子的每条链酶∶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物∶RNA引物，温和的反应条件7.总结：PCR与体内DNA分子复制的不同点：PCR DNA复制复制起点无有复制叉无有场所及条件体外；控制3个不同温度体内细胞核、线粒体、叶绿体；温和条件步骤变性、退火、延伸起始、延伸、终止酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物2种，一小段与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链DNA；人工合成多种RNA做引物；自行合成引物是否去除否是变性的条件90℃以上的高温解旋酶结果短时间内快速扩增目的基因片段复制完整的DNA分子特点半保留复制两条链连续合成半保留复制半不连续复制8.PCR技术在基因工程中的应用：（1）特异性、快速扩增目的基因获取目的基因（2）目的基因的检测与鉴定9.用PCR技术可以扩增mRNA吗？不可以；在逆转录酶的作用下，需以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA再进行扩增10.提取mRNA扩增目的基因的过程：第一步：逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子第二步：核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子第四步：以双链DNA分子为模板，经过③变性、④复性、⑤延伸，循环扩增形成目的基因产物11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些结构：启动子、内含子、终止子12.目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是：Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活13.PCR产物的影响因素：模板DNA的量、脱氧核苷酸的量、引物的量、酶的数量和活性、循环次数、Mg2+的浓度14.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多15.变性温度过低会导致双链不能充分解开；16：PCR扩增中预变性的目的：预变性破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤PCR扩增的原理和步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是⼀种分⼦⽣物学技术，⽤于放⼤特定的DNA⽚段。
可看作⽣物体外的特殊DNA复制。
DNA 聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，⽽较具有实验价值及实⽤性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐⾼温，⾼温能使之变性, 因此不符合使⽤⾼温变性的聚合酶链式反应。
现今所使⽤的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐⾼温，是⼀个很理想的酶，但它被⼴泛运⽤则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第⼀个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
⽽现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE 公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等⼈正式发表了第⼀篇相关的论⽂。
此后，PCR的运⽤⼀⽇千⾥，相关的论⽂发表质量可以说是令众多其它研究⽅法难望其项背。
随后PCR技术在⽣物科研和临床应⽤中得以⼴泛应⽤，成为分⼦⽣物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退⽕--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热⾄93℃左右⼀定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退⽕(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降⾄55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作⽤下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成⼀条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退⽕--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，⽽且这种新链⼜可成为下次循环的模板。
PCR详细
30 s
30 s 1 kb/min 5 min 25-35个循环
备注：* 比两条引物的Tm值低5~10℃。
PCR产物电泳鉴定
凝胶准备 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE；
② 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；
③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 5μl，并轻轻混匀。 胶床准备
dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP） 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑 制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减 少在非靶位臵启动和延伸时核苷酸错误掺 入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓 度太低，势必降低反应物的产量。PCR常 用的浓度为50～200μM，不能低于10～ 15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任 何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶 的错误掺入，降低合成速度，过早终止反 应。
PCR缓冲液: 用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris – HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。在 72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位， 接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要， 影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+ 优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易 生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量 降低。首次使用靶序列和引物结合时，都 要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为 1～10mmol/L。
修复机制，所以，在PCR产物扩增以后，仍要分析其与模板DNA的是否完全一致。
最好的方法是将PCR产物测序，将测序结果与数据库作序列比对分析。
/Blast.cgi
核酸序列比对
BLAST分析界面
输入测序结果
目的基因的扩增及扩增产物鉴定分析报告
扩增条件优化
温度循环
根据所使用的DNA聚合酶特性，设 置合适的温度循环，包括变性、退火 、延伸等温度设置。
延伸时间
根据目的基因长度和DNA聚合酶活 性，设置合适的延伸时间。
循环数
根据目的基因浓度和扩增效率，确定 合适的循环数，避免非特异性扩增和 过度扩增。
产物检测
扩增后对产物进行电泳检测，确认目 的基因是否成功扩增。
关重要。
产物纯度评估
总结词
产物纯度评估是判断扩增产物质量的重要环节，有助于提高后续实验的准确性 和可靠性。
详细描述
通过电泳、质谱分析、光谱分析等方法评估产物纯度，可以了解扩增产物中杂 质成分的含量，从而判断产物的质量。产物纯度评估对于后续的实验操作和应 用研究具有重要意义。
04
目的基因的功能研究
产物鉴定
通过DNA测序，证实了目的基因 的准确性，与预期序列一致，进 一步验证了扩增产物的可靠性。
研究意义与价值
01
基础研究
本实验为深入了解目的基因的结 构和功能提供了基础数据，有助 于推动相关领域的研究进展。
02
生物技术应用
03
疾病诊断与治疗
成功扩增目的基因可为基因克隆 、基因表达、基因治疗等生物技 术应用提供关键材料。
目的基因的扩增及扩增 产物鉴定分析报告
目录 CONTENT
• 目的基因的扩增 • 扩增产物的鉴定 • 数据分析与解读 • 目的基因的功能研究 • 结论与展望
01
目的基因的扩增
引物设计
引物长度
根据目的基因序列，选择合适的引物长度，通常为18-24个核苷 酸。
引物特异性
确保引物与目的基因特异性结合，避免与基因组其他部分发生非特 异性结合。
基础学习实验8目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定
Ezrin定位与染色体6q25.2-q26，DNA长度为1761个碱基，含13个外显子。
Ezrin的编码区序列
ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAA ACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAG GATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTC CGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAA GGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGT TTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAG CACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGC TATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAA CAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTT CCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTT TGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCC GCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGG CAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT GATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGC AGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAG GAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAA GATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGG ATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCG GTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGG CATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGC TGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAA GGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA
PCR 技术的种类及其应用
PCR 技术的种类及其应用1PCR 技术的基本原理PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下，依赖于DNA聚合酶（T aq酶)的酶促合成反应。
其具体反应分三步：变性、退火、聚合.以上三步为一个循环, 每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板,数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。
2PCR技术的种类2。
1反向PCR（Inverse PCR, IPCR）技术原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I）NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板,用一对与已知序列两端特异性结合的引物,扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。
这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术用酶法在一通用引物反转录cDNA3'—末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
应用:它可用于扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。
2。
3不对称PCR（asymmetric PCR)技术两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。
在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用50～100÷1比例。
实验四 PCR扩增目的基因课件PPT
engineering of DNA
• 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence
variations
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PCR反应中的成份
1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所 决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
分子生物学实验 Experiments of molecular biology
实验四 PCR扩增目的基因
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1
实验二 PCR扩增目的基因
【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ； 3．了解PCR的优化环节，学会如何优化PCR。了
6
3. PCR管内加好上述试剂之后要充分混合，然后离心数 秒，放入PCR仪上。
4. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪， 电泳。
PCR完成后，取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行 电泳分析，检查反应产物及长度。
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电泳结果如图所示
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[注意] 1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
• 体外程序化的DNA合成技术。
devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
基因工程中目的基因的检测pcr法
基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。
它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。
在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。
聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。
PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。
这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。
通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。
通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。
在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。
它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。
通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。
通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。
为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。
引物的设计至关重要。
引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。
实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。
任何微小的偏差都可能导致结果的误判。
在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。
假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。
因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。
随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。
这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定
重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定【摘要】目的：利用PCR技术[1]扩增hIL-8 cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a〔含PL启动子〕质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。
方法：PCR技术扩增hIL-8 cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。
结果：带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。
结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。
【关键词】hIL-8， PCR ，重组DNA【Summary】Purpose：Connecting the hIL-8 cDNA which is amplificated using PCR technology with the plasmid of prokaryotic expression vector digested pKpL3a (including PL promoter),and detecting the expression and identification of 。
Method：Get target gene by amplificating hIL-8 cDNA using PCR technology. Extract the E.coli plasmid. Connect the target gene with E.coli plasmid pKpL3a expression vector. Transform recombination DNA into E.coli Pop2136, and regulate gene expression of exogenous using the temperature-sensitive λ repressor protein, then detect the expression levels by ELISA reaction。
-PCR基因扩增及扩增产物的回收ppt课件
避免连续相同碱基排列或内部回文序列
5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC 3’
发卡结构
CTGCCAGTCTAC 3’ T GACGG 5’
2.4 避免形成引物二聚体（dimer）
两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列
primer1 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
ACGTACGTA 5’
模板
DNA链的延伸：DNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板 上延伸DNA链。
模板
5’ ATCTTGAAC Taq
72 ℃
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq ACGTACGTA 5’
模板
变性—复性—延伸
1个循环的结果
1201 gagcgcgacc agtgaaaaat gtccgggtaa cgctctggaa aaaggcggaa 1251 aaggatcgat taccgaacag ctgcttaacg ctcgtgccga cgttacgctt
1301 ggcggcggcg caaaaacctt tgctgaaacg gcaaccgctg gtgaatggca 1351 gggaaaaacg ctgcgtgaac aggcacaggc gcgtggttat cagttggtga 1401 gcgatgctgc ctcactgaat tcggtgacgg aagcgaatca gcaaaaaccc
使PCR成为实用的方法
DNA模板高温变性: 双链DNA在受热后，配对碱基 的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
pcr扩增实验报告
pcr扩增实验报告篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA 的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+(镁离子作用是酶的催化剂，没有镁离子酶就没办法扩增)。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
三部曲：变性、退火、延伸1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65℃时，部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合。
基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定
因扩增。
多重PCR技术
多重PCR技术可实现在同一反应体系中同 时扩增多个目标基因，提高检测效率和通
量。
数字PCR技术
数字PCR技术将进一步提高PCR的定量准 确性和灵敏度，为精准医疗和科研领域提 供更可靠的数据支持。
智能化PCR仪器
序列拼接与组装
对于较长的目标序列，可能需要将多个测序片段进行拼接和组装，以获
得完整的基因序列。通过拼接和组装，可以得到更准确的基因序列信息
。
03
突变与多态性分析
通过分析测序结果中的差异位点和突变情况，可以了解基因的多态性、
突变类型以及可能的生物学意义。
荧光定量PCR结果分析
确定扩增曲线和Ct值
荧光定量PCR结果通常以扩增曲线和Ct值的形式呈现。通过观察扩增曲线的形状和Ct值的大小，可以判断PCR反应的 效率和特异性。
比较不同样本或不同条件下的结果
通过比较不同样本或不同条件下的凝胶电泳图谱，可以观 察PCR产物的差异，进一步分析基因表达的差异或突变情 况。
测序结果分析
01
序列比对
将测序得到的序列与已知的目标基因序列进行比对，确认PCR产物与目
标序列的一致性。比对结果可以显示序列的相似度、差异位点和突变情
况。
02
凝胶电泳法
原理
凝胶电泳法是一种通过电场作用 使DNA分子在凝胶介质中移动， 根据分子大小进行分离的技术。 PCR产物经过凝胶电泳后，可以 通过观察条带的数量和位置来判
断PCR扩增的特异性。
操作步骤
PCR产物与DNA Marker一起加 入凝胶孔中，进行电泳。电泳结
束后，通过染色和脱色步骤使 DNA条带可视化。
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因克隆：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
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C. 100 bp DNA marker
Fascin 基因
Fascin蛋白的mRNA全长为2767bp，由5„端非翻译区111bp碱基，3‟端非翻译区1174bp 碱基，1482bp的全编码序列区和6个PloyA信号肽组成，编码493个氨基酸，分子量约 为55kD。 Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)，边缘的丝状伪足(filopodia)、 微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。 以往研究发现，Fascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌Hela、胃癌AGS、 大肠癌LM1215和SW480、胰腺癌BxPC3和T3H4等细胞系中均上调表达。 细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示Fascin蛋白可 能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。
候选基因简介
在本实验中，有三个候选基因，分别是NGAL，Fascin和Ezrin。 这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展 中起重要的生物学作用。 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进 行了深入研究，在国外杂志上发表SCI收录研究论文20余篇，已形成系列优势。
综合性设计性实验-8
目的基因的PCR扩增 及其扩增产物的鉴定分析
此实验共包括如下六个部分
1. 第一部分，目的基因选择
2. 第二部分，PCR引物设计
3. 第三部分，PCR实验操作 4. 第四部分，PCR产物电泳鉴定 5. 第五部分，PCR产物测序鉴定 6. 第六部分，目的基因序列变异分析
第一部分，目的基因选择
设计并合成了靶向Fascin基因的siRNA，试图通过RNA干扰的方法减少Fascin基因的表
达，从而探讨Fascin对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。
扫描电镜结果显示抑制Fascin表达后，EC109细胞突触形成明显减少。
A
B
细胞免疫荧光结果显示代表Fascin蛋白的绿色荧 光在被干扰细胞（A）中要比对照细胞（B）的弱
Ezrin基因
Ezrin为ERM（Ezrin,radixin,moesin ）蛋白家族成员之一，ERM家族成员大多位于丝状突
和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这
样可维持细胞膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。 ERM家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互 作用参与细胞粘附作用降。 ERM家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过Rho-GTP酶参与信号转导。
可以帮助判定缺血性肾损伤程度。
NGAL的mRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完
整编码区的有BC033089和NM_005564等，编码区长为597 bp，编码198个氨基酸，包含
了N端前部长为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1-60 bp）。
NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列： 前20个AA 为信号肽序 列
Fascin基因的编码区序列
ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGAC GGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAG CAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACA AGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGAC GGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGC GCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCAC CCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGC GTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGC CACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGG CCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCAC CAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAG AGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCA GCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCA CCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGC ATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGAC AGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTT CATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAA CGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCA GCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCT ACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTAC TAG
Ezrin的编码区序列
ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAA ACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAG GATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTC CGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAA GGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGT TTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAG CACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGC TATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAA CAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTT CCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTT TGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCC GCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGG CAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT GATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGC AGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAG GAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAA GATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGG ATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCG GTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGG CATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGC TGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAA GGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA