实时荧光定量PCR

线性图谱
对数图谱
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基线
阈值
Ct值
什么是阈值？
[DNA]0
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
5’ 3’
下游引物
R
3’ 5’
Q
5’ 3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针 2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号 3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
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SYBR Green Ⅰ染料
26
SYBR Green Ⅰ作用机理
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SYBR Green Ⅰ作用机理 1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信பைடு நூலகம்强度与DNA分子总数目成正比
基线
阈 值
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C T值
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。
设n=CT，则：
RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs log (RCT - RB) = log X0 + CT log (1+ e) + log Rs CT log (1+ e) = - log X0 + log (RCT - RB) – log Rs
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荧光标记方法的原理
●探
针
– TaqMan – TaqMan MGB
●染
料
– SYBR Green I
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TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光
log X O log( RT − R B ) − log RS + CT = − log(1 + E X ) log(1 + E X )
即 CT = - k lg X0 + b
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（线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
C T值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
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定量PCR的化学原理
实时荧光定量PCR原理
王争强
Application Specialist, MCB Hotline: 4006209660 cnmcbsupport@appliedbiosystems.com
定量PCR技术的应用
绝对定量（Absolute Quantification） 相对定量（Relative Quantification） MicroRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷贝数变异（CNV Research） 蛋白与基因相互作用（Gene Regulation） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping） 阴阳性分析（Positive/Minus Assay） 转基因成分检测（GMO Detection） 基因扫描（Gene Scan） 蛋白熔解曲线（Protein Melting） 。。。。。。。。。
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荧光共振能量传递
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）探针是 根据荧光能量共振传递原理设计的探针。
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TaqMan---水解型杂交探针
E
R
E
Q
E
R
23
E
Q
TaqMan作用机理
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TaqMan作用机理
上游引物
3’ 5’
R
TaqMan 探针
Q
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熔解曲线(Dissociation curve)
Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有 关，可部分代表序列的特异性 PCR过程中，控制温度缓慢升高 ，双链DNA解链成为单链DNA，SYBR Green 被释放，荧光信号减弱 对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即Tm.
2
内容
● ● ●
AB公司及其荧光PCR仪 定量PCR的数学原理 荧光PCR的化学原理
3
AB公司及其荧光PCR仪
美国AB公司荧光定量PCR仪发展历史
● ● ● ●
1996年：Applied Biosystems公司发明世界上第一台定量PCR仪7700型； 1997年：ABI面向医院用户推出5700型定量PCR仪，至今许多医院仍在使用； 2000年：ABI推出7900型荧光定量PCR仪，该型号公认为业界最高端定量PCR仪； 2001年：ABI推出7000型荧光定量PCR仪取得巨大成功，以其科学的设计理念获得2002年“最佳仪器奖” （Best Instrument Winner 2002)称号；
●
2003年：ABI在继拥有PCR仪的专利之后，又获得了荧光定量PCR仪的专利，反映了ABI在PCR业界内 的独特地位。所有其他公司均需得到ABI的专利授权许可；
●
2004年：ABI在7000的基础上推出了第3代荧光定量PCR仪7300和7500型，该两款型号目前已为广大用 户所熟知，拥有极佳的口碑；
定量PCR仪家族
第一代 7700 5700 第二代 7000 7900 第三代 7300 7500 第四代 stepone /plus
6
定量PCR的数学原理
什么是PCR?
模板，引物，dNTP 缓冲液、镁离子 DNA 聚合酶
F
5 primer 3 ' ' 5 ' 5 ' 3 '
链式反应的雪崩效应
5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
5 ' R primer
5 3 ' ' 5 '
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' '
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特异性的熔解曲线
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定量PCR的光学原理
典型的光学结构图
光源 滤光镜 反射镜 CCD 相机 夫累尔透镜 96孔透镜组 滤镜轮 96孔板 双色镜 多元镜
32
●
2007年：ABI推出了第4代荧光定量PCR仪StepOne和StepOnePlus，以操作的灵活方便性和快速、现代 的设计理念为市场所瞩目。在欧美、日本等地广泛受到好评。2007年IBO 2007年度工业设计大奖， 2008年获得SelectScience的2007年年度最佳生命科学新仪器奖。
5
常用的荧光标记方法
●
DNA双链染料 SYBR Green 、LC Green、Cyto9、Evagreen
●
序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons（分子信标） Dual Probes (FRET)
●
引物特异性探针 Amplifluor
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荧光的原理
Light
荧光基团发光原理：在一束特定波长（如500nm）激发光源的作用下，荧光基团的电子向高能级跃迁 ，随后从高能级跃迁回较低的能级，释放特定波长的光（如600nm），这个光称为发射光。 由于电子从高能级跃迁回来的时候会损失部分能量，所以发射光的能量会比激发光能量小，结果就是 发射光的波长比激发光波长向红外移动（紫外能量大，红外能量小）。
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' '
5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
8
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
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基线
阈值
Ct值
[DNA]0
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基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
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基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是CT值？
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 线性图谱 对数图谱
CT值
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CT值
基线调整规则
如果CT值 >18，不需调整，使用自动分析结果 如果CT值 <18，修改终点，再分析一次 起 点：进口试剂取3，国产试剂取6 终 点：最小的CT值 – 4，通常为15 长 度：大于或等于6个循环