实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它通过利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，从而可以快速、准确地定量目标序列的数量。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此被广泛应用于基础研究、临床诊断、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面。
首先，PCR反应是实时荧光定量PCR的核心步骤。
PCR反应通过不断循环的高温变性、低温退火和中温延伸，使目标DNA序列得以扩增。
在每一个PCR循环中，目标序列的数量呈指数增长，这种指数增长的特点为后续的定量提供了基础。
其次，荧光探针是实时荧光定量PCR的关键。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光淬灭剂的寡核苷酸探针，它与目标序列特异性结合，并在PCR反应中被3'→5'外切酶切割，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，因此可以通过监测荧光信号的变化来实现对目标序列数量的实时定量。
最后，检测系统是实时荧光定量PCR的重要组成部分。
检测系统包括荧光定量PCR仪和数据分析软件，它能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度，并将荧光信号转化为目标序列的数量。
通过合理设置PCR反应条件和分析荧光信号的曲线，可以实现对目标序列的快速、准确定量。
总的来说，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合，通过PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面的协同作用，实现对目标序列数量的实时定量。
这种原理使实时荧光定量PCR成为一种高效、快速、准确的分子生物学技术，为科研和临床诊断提供了重要的技术支持。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。
首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。
双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。
DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。
这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。
实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。
最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。
在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR国际化标准(一)
实时荧光定量PCR国际化标准（一）引言概述:实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度和高特异性的核酸检测方法。
随着其在基础科学研究、临床诊断和生物工程中的广泛应用，国际化标准的建立变得尤为重要。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的相关内容。
正文:一、样品准备1. 样品的收集、保存和预处理2. 样品加载量的标准化3. 样品质量验证和污染检测4. 基因组DNA和cDNA的质量控制5. 防止样品交叉污染的措施二、引物和探针设计1. 引物和探针序列选择的标准2. 引物和探针的纯化和稀释3. 引物和探针的特异性验证4. 引物和探针设计软件的使用5. 引物和探针批次一致性的验证三、PCR反应体系和条件1. PCR反应体系的配制2. 反应管的选择和处理3. 温度梯度实验和温度优化4. 补偿和矫正实验条件中的误差5. PCR反应重复性的验证四、阳性和阴性对照1. 阳性对照品的选择和制备2. 阳性对照品的定量和标准化3. 阴性对照的添加和验证4. 阳性和阴性对照的检测范围和灵敏度5. 对照品的质量控制和存储五、数据分析和结果解释1. 荧光曲线分析和阈值设置2. 标准曲线的绘制和斜率计算3. 样品浓度的计算和质权矫正4. 数据处理和统计分析方法5. 结果的解释和报告撰写总结:实时荧光定量PCR国际化标准的确立对于确保实验结果的准确性、可比性和可重复性具有重要意义。
通过规范样品准备、引物和探针设计、PCR反应体系和条件、阳性和阴性对照以及数据分析和结果解释等环节，我们能够实现实时荧光定量PCR方法的国际化标准化，从而为该技术的应用提供更可靠的支持。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
实时荧光定量pcr标准曲线
实时荧光定量pcr标准曲线实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测DNA 或RNA的定量分析技术，其基本原理是利用DNA或RNA在PCR过程中产生的荧光信号来实时监测目标序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR标准曲线是评估PCR反应效率和定量分析的重要工具，下面将介绍实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法及其在定量分析中的应用。
1. 实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法。
实时荧光定量PCR标准曲线的构建需要使用一系列已知浓度的模板DNA或RNA标准品，通过对这些标准品进行系列稀释，得到一系列浓度不同的标准曲线点。
在PCR反应中，利用这些标准曲线点进行定量分析，可以得到PCR反应的效率和灵敏度。
首先，选择合适的模板DNA或RNA标准品，可以是纯化的基因片段、合成的基因片段或者已知浓度的cDNA。
然后，对标准品进行系列稀释，通常选择10倍稀释系列，以得到一系列浓度不同的标准曲线点。
接下来，进行实时荧光定量PCR反应，利用这些标准曲线点进行定量分析，得到PCR反应的效率和灵敏度。
2. 实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中的应用。
实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中起着至关重要的作用。
首先，通过标准曲线可以评估PCR反应的效率，即每个循环的扩增倍数，从而判断PCR反应的质量和稳定性。
其次，利用标准曲线可以进行定量分析，计算待测样品中目标基因的相对或绝对含量，从而实现对目标基因的定量检测。
在实际操作中，构建实时荧光定量PCR标准曲线需要严格控制实验条件，确保反应体系的稳定性和准确性。
此外，选择合适的荧光探针和引物对于实时荧光定量PCR的准确性和灵敏度也至关重要。
总之，实时荧光定量PCR标准曲线是实时荧光定量PCR技术中的重要工具，其构建和应用对于PCR反应的效率评估和目标基因的定量分析具有重要意义。
在实际应用中，科研人员需要充分理解实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法和应用原理，以确保实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：实验试剂及耗材：试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master1号管包含：热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2仪器及耗材：罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】二、反转录实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。
严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。
本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。
其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。
实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。
在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。
当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。
而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。
根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。
为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。
首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。
根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。
最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。
实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。
它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。
相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR），也称为荧光定量PCR，是一种常用于检测和定量DNA或RNA的分子生物学技术。
相比传统的PCR方法，实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度、准确性和特异性，能够量化目标核酸序列的含量。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应的进行和荧光信号的检测与实时监测。
PCR反应是通过逐渐升高的温度循环，使DNA链解链、引物与模板相互结合，合成新的DNA链，不断扩增目标序列的过程。
荧光信号的检测是通过加入特定的荧光探针，在PCR反应过程中的每个循环都量化目标序列的含量，并以荧光信号的强度来表示。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的方法及其一般步骤。
1. 样品处理与提取：首先需要从待测样品中提取出目标DNA或RNA的模板，并进行适当的处理。
比如，可以使用细胞裂解液或提取试剂盒来裂解和纯化细胞或组织中的核酸。
2. 反转录：对于需要检测的RNA目标，需要先将其反转录为cDNA。
这一步骤通常使用反转录酶和适当的引物，在一定的温度条件下合成cDNA。
反转录反应通常在37-42C进行。
3. 扩增反应体系制备：根据实验需要和反应装置的规格，配制好PCR反应的体系。
体系中的成分通常包括模板DNA（cDNA或DNA模板）、引物（前向引物和逆向引物）、荧光标记探针（如TaqMan探针）、聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTPs等。
4. PCR扩增条件设置：根据模板DNA的长度和序列特性，设置PCR反应的温度和时间条件。
通常，PCR反应的温度包括初始变性（95C）、扩增（56-72C）和延伸（72C）等多个循环。
5. 荧光信号的检测与实时监测：PCR反应过程中，可以通过专用的实时荧光定量PCR仪器进行检测和监测。
这类仪器常常能够实时记录PCR反应的荧光信号强度，并产生实时的反应曲线图。
根据荧光信号的强度变化，可以推断目标DNA 或RNA的含量。
实时荧光定量pcr原理
实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的定量分析技术，它结合了PCR技术和实时荧光检测技术，可以实现对目标序列的快速、准确和高灵敏度的定量检测。
本文将介绍实时荧光定量PCR的原理及其在科研和临床诊断中的应用。
首先，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合。
在PCR过程中，DNA或RNA模板会被特异性引物引导进行扩增，同时荧光探针与目标序列结合并释放出荧光信号。
随着PCR的进行，目标序列的数量会不断增加，荧光信号也会随之增加。
利用荧光检测仪器可以实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，从而实现对PCR反应过程的实时监测和定量分析。
实时荧光定量PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和高准确性。
相比于传统的终点荧光定量PCR，实时荧光定量PCR可以在PCR反应过程中实时监测目标序列的扩增情况，从而可以准确地确定起始模板的数量。
此外，实时荧光定量PCR还可以通过荧光探针的设计实现多重PCR反应的同时检测，大大提高了检测的通量和效率。
在科研领域，实时荧光定量PCR被广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、基因突变分析等领域。
通过实时监测PCR反应过程中的荧光信号，可以准确地确定不同样本中目标基因的表达水平，从而揭示基因在生理和病理过程中的作用。
在临床诊断中，实时荧光定量PCR也被用于病原微生物的检测和基因突变的筛查，其高灵敏度和高特异性使其成为临床诊断的重要辅助手段。
总之，实时荧光定量PCR作为一种高效、准确的定量分析技术，已经成为科研和临床诊断中不可或缺的工具。
其原理简单、操作方便，可以快速、准确地实现对DNA或RNA的定量分析。
随着技术的不断进步和发展，相信实时荧光定量PCR在科研和临床诊断中的应用前景将更加广阔。
实时荧光定量pcr的基本原理
实时荧光定量pcr的基本原理宝子们！今天咱们来唠唠一个超酷的生物技术——实时荧光定量PCR。
这玩意儿听起来是不是有点高大上？其实呀，理解起来也没那么难啦。
PCR呢，全称是聚合酶链式反应，就像是一个基因复印机。
它能把咱们想要研究的那一小段基因，像复印机复印文件一样，不断地复制，让本来很少很少的基因变得多多的，这样咱们就好研究啦。
但是呢，普通的PCR只能告诉我们有没有这个基因，就像只知道有没有这个东西，却不知道有多少。
这时候，实时荧光定量PCR就闪亮登场啦。
实时荧光定量PCR的特别之处就在这个“荧光”和“定量”上。
咱先说说这个荧光。
想象一下，基因就像是一群小怪兽，而我们给它们身上都贴上了会发光的小标签。
这个小标签就是荧光染料或者荧光探针啦。
当PCR在复制基因的时候呢，每复制出一份新的基因，就会有一个小标签亮起来，就像小怪兽每繁殖一个就会亮起一盏小灯一样。
随着反应的进行，小灯越来越多，荧光也就越来越强啦。
那这个定量是咋回事呢？这就像是数小灯的个数来知道小怪兽有多少一样。
仪器会一直盯着这些荧光，然后根据荧光的强度来计算出最开始有多少个基因。
比如说，荧光强一点，那就说明最开始的基因数量多一些；荧光弱一点，那最开始的基因就少一些。
是不是很神奇呀？而且哦，这个实时荧光定量PCR可聪明啦。
它在反应的过程中就一直在检测荧光，不像普通的PCR要等反应结束了才知道结果。
这就好比我们做蛋糕，普通PCR是等蛋糕烤好了才知道烤得咋样，而实时荧光定量PCR呢，在烤蛋糕的过程中就一直在看，要是发现有点不对劲，马上就能调整。
这样就可以更准确地知道基因复制的情况啦。
在实际应用里，实时荧光定量PCR可帮了大忙呢。
比如说在医学上，要是怀疑一个人感染了某种病毒，就可以用这个技术来看看他身体里病毒的基因有多少。
如果病毒基因数量在增加，那就说明病毒在身体里还很活跃，得赶紧想办法治疗。
在科研上，研究人员想知道某个基因在不同环境下的表达情况，也可以用这个技术。
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
03
Taqman探针的合成与制备
探针的合成方法
化学合成法
通过化学反应将荧光基团和淬灭基团分别连接到DNA或RNA的5'和3'末端，形成 Taqman探针。
酶促合成法
利用DNA聚合酶将荧光基团和淬灭基团分别添加到DNA或RNA的特定位置，形成 Taqman探针。
探针的质量检测与纯化
质量检测
通过电泳、质谱和光谱分析等方法检测探针 的长度、荧光基团和淬灭基团的数量和位置 ，以及探针的纯度。
定义与原理
定义
实时荧光定量PCR-Taqman探针法是 一种基于荧光信号的实时监测技术， 用于定量分析DNA或RNA的拷贝数。
原理
通过在Taq酶催化下，利用荧光染料 标记的特异性探针与待测核酸进行特 异性结合，在PCR循环过程中实时监 测荧光信号的增强，从而实现对核酸 的定量分析。
发展历程与现状
02
Taqman探针的设计原则
探针的长度与结构
长度
通常为20-30bp，确保特异性并减少非特异性扩增。
结构
由报告基团、淬灭基团和连接臂组成，连接臂长度一般为5-6个脱氧核糖核苷酸。
探针的特异性
针对目标序列
确保探针与目标序列完全匹配，避免 交叉反应。
序列选择
选择基因特异性区域，避免基因组中 的高变区。
04
Taqman探针在实时荧光定量 PCR中的应用
样本处理与PCR反应体系建立
样本处理
确保样本质量，去除杂质和抑制剂，提 取高质量的DNA或RNA。
Taqman探针设计
根据目标基因序列设计Taqman探针， 确保探针的特异性和荧光信号的稳定
性。
引物设计
根据目标基因序列设计特异性引物， 确保引物与模板的结合效率和特异性。
实时荧光定量pcr技术原理
实时荧光定量pcr技术原理宝子们！今天咱们来唠唠一个超酷的技术——实时荧光定量PCR技术。
这玩意儿听起来是不是就感觉很厉害的样子？那啥是PCR呢？PCR就像是一个复印机，不过它复印的不是文件，而是DNA。
普通的PCR就是把一小段DNA不断地复制，让它的数量变得超级多。
就好像你有一颗小种子，然后通过某种魔法，让它变成一大片花海，超神奇的吧！那实时荧光定量PCR呢，它可不只是简单地复制DNA哦。
它呀，在复制的过程中还能实时地检测DNA的数量。
这就好比你在种小种子的时候，还能随时知道已经长出来多少朵花了。
这里面有个关键的东西就是荧光染料或者荧光探针啦。
咱先说说荧光染料这个小机灵鬼。
荧光染料就像一个小间谍，它特别喜欢和DNA结合。
当它和DNA结合的时候呢，就会发出荧光信号。
随着DNA被复制得越来越多，结合的荧光染料也就越来越多，那发出的荧光信号就越来越强啦。
就像一群小萤火虫，最开始只有几只，慢慢地就变得好多好多，整个地方都亮闪闪的。
再说说荧光探针这个有趣的家伙。
荧光探针就像是一个带着特殊任务的小信使。
它的结构有点特别，一头是荧光基团，另一头是淬灭基团。
在没有发生反应的时候呢，这个荧光基团发出的光会被淬灭基团给弄没了，就像你想点亮一个小灯，但是旁边有个小怪兽把光给吞掉了。
可是呢，当PCR反应进行的时候，这个探针会和DNA结合，然后就像一把小剪刀把探针剪断了，这样荧光基团就自由啦，就可以发出明亮的荧光啦。
是不是感觉像一场小小的魔法秀呢？那这个技术为啥这么有用呢？它可以用来检测很多东西哦。
比如说在医学上，可以检测病毒的数量。
如果有个病人感染了病毒，通过这个技术就能知道他身体里到底有多少病毒在捣乱。
这就像我们要和病毒打仗，得先知道敌人有多少兵力一样。
如果病毒数量很多，那我们就得用更厉害的武器去对付它。
在科研上，这个技术也超棒的。
可以用来研究基因的表达量。
就像每个基因都有自己的小脾气，有的时候很活跃，表达量就高；有的时候就很安静，表达量就低。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系 统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断 和个体化用药分析的首选技术平台。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞 争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物 被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已 知模板推测未知模板的起始拷贝数。
谢谢观看
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地 高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加 入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
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21
荧光共振能量传递
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）探针是 根据荧光能量共振传递原理设计的探针。
22
TaqMan---水解型杂交探针
E
R
E
Q
E
R
23
E
Q
TaqMan作用机理
24
TaqMan作用机理
上游引物
3’ 5’
R
TaqMan 探针
Q
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' '
5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
8
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
9
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
10
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
29
特异性的熔解曲线
30
定量PCR的光学原理
典型的光学结构图
光源 滤光镜 反射镜 CCD 相机 夫累尔透镜 96孔透镜组 滤镜轮 96孔板 双色镜 多元镜
32
基线
阈 值
14
C T值
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。
设n=CT，则：
RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs log (RCT - RB) = log X0 + CT log (1+ e) + log Rs CT log (1+ e) = - log X0 + log (RCT - RB) – log Rs
实时荧光定量PCR原理
王争强
Application Specialist, MCB Hotline: 4006209660 cnmcbsupport@
定量PCR技术的应用
绝对定量（Absolute Quantification） 相对定量（Relative Quantification） MicroRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷贝数变异（CNV Research） 蛋白与基因相互作用（Gene Regulation） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping） 阴阳性分析（Positive/Minus Assay） 转基因成分检测（GMO Detection） 基因扫描（Gene Scan） 蛋白熔解曲线（Protein Melting） 。。。。。。。。。
12
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是CT值？
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 线性图谱 对数图谱
CT值
13
CT值
基线调整规则
如果CT值 >18，不需调整，使用自动分析结果 如果CT值 <18，修改终点，再分析一次 起 点：进口试剂取3，国产试剂取6 终 点：最小的CT值 – 4，通常为15 长 度：大于或等于6个循环
●
Hale Waihona Puke 2007年：ABI推出了第4代荧光定量PCR仪StepOne和StepOnePlus，以操作的灵活方便性和快速、现代 的设计理念为市场所瞩目。在欧美、日本等地广泛受到好评。2007年IBO 2007年度工业设计大奖， 2008年获得SelectScience的2007年年度最佳生命科学新仪器奖。
5
2
内容
● ● ●
AB公司及其荧光PCR仪 定量PCR的数学原理 荧光PCR的化学原理
3
AB公司及其荧光PCR仪
美国AB公司荧光定量PCR仪发展历史
● ● ● ●
1996年：Applied Biosystems公司发明世界上第一台定量PCR仪7700型； 1997年：ABI面向医院用户推出5700型定量PCR仪，至今许多医院仍在使用； 2000年：ABI推出7900型荧光定量PCR仪，该型号公认为业界最高端定量PCR仪； 2001年：ABI推出7000型荧光定量PCR仪取得巨大成功，以其科学的设计理念获得2002年“最佳仪器奖” （Best Instrument Winner 2002)称号；
log X O log( RT − R B ) − log RS + CT = − log(1 + E X ) log(1 + E X )
即 CT = - k lg X0 + b
15
（线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
C T值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
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定量PCR的化学原理
常用的荧光标记方法
●
DNA双链染料 SYBR Green 、LC Green、Cyto9、Evagreen
●
序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons（分子信标） Dual Probes (FRET)
●
引物特异性探针 Amplifluor
18
荧光的原理
Light
荧光基团发光原理：在一束特定波长（如500nm）激发光源的作用下，荧光基团的电子向高能级跃迁 ，随后从高能级跃迁回较低的能级，释放特定波长的光（如600nm），这个光称为发射光。 由于电子从高能级跃迁回来的时候会损失部分能量，所以发射光的能量会比激发光能量小，结果就是 发射光的波长比激发光波长向红外移动（紫外能量大，红外能量小）。
28
熔解曲线(Dissociation curve)
Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有 关，可部分代表序列的特异性 PCR过程中，控制温度缓慢升高 ，双链DNA解链成为单链DNA，SYBR Green 被释放，荧光信号减弱 对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即Tm.
19
荧光标记方法的原理
●探
针
– TaqMan – TaqMan MGB
●染
料
– SYBR Green I
20
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光
线性图谱
对数图谱
11
基线
阈值
Ct值
什么是阈值？
[DNA]0
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
5’ 3’
下游引物
R
3’ 5’
Q
5’ 3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针 2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号 3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
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SYBR Green Ⅰ染料
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SYBR Green Ⅰ作用机理
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SYBR Green Ⅰ作用机理 1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信号强度与DNA分子总数目成正比
5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 3 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
5 ' R primer
5 3 ' ' 5 '
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' '
定量PCR仪家族
第一代 7700 5700 第二代 7000 7900 第三代 7300 7500 第四代 stepone /plus
6
定量PCR的数学原理
什么是PCR?
模板，引物，dNTP 缓冲液、镁离子 DNA 聚合酶
F
5 primer 3 ' ' 5 ' 5 ' 3 '
链式反应的雪崩效应
●
2003年：ABI在继拥有PCR仪的专利之后，又获得了荧光定量PCR仪的专利，反映了ABI在PCR业界内 的独特地位。所有其他公司均需得到ABI的专利授权许可；
●
2004年：ABI在7000的基础上推出了第3代荧光定量PCR仪7300和7500型，该两款型号目前已为广大用 户所熟知，拥有极佳的口碑；