电泳技术的基本原理2
电泳技术
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电泳技术 第一节 概述 一、基本原理 二、凝胶支持介质 三、检测方法 四、电泳仪器 第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、基本原理 二、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 三、影响分离效果的因素 四、蛋白质分子量的测定 五、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法 六、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围
Hale Waihona Puke 二.凝胶支持介质• 聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是蛋白质电泳中两种杰 出的介质。在通常使用的浓度下,聚丙烯酰胺凝 胶的孔径大小与蛋白质分子属于同一数量级,因 此被认为是分子筛凝胶,而琼脂糖凝胶的孔径较 大,被认为是非分子筛凝胶。 • 三、检测方法 • 在大多数情况下,当电泳结束后,被分离的蛋白 质区带仍然保持在胶内,这时可以通过染色而显 示出分离图谱,从而检测样品的分离情况。常用 的全蛋白质染色方法是考马斯亮蓝法和银染法。
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于是有m=Q/6πrη 即迁移率与球形分子的半径,介质黏度,颗粒 所带电荷有关。 • 带电颗粒在电场中的迁移速度与本身所带的静 电荷的数量,颗粒大小和形状有关。一般来说, 所带静电荷越多,颗粒越小,越接近球形,则在 电场中迁移速度越大,反之越慢。
3.电渗 • 电渗就是流动相相对于固体支持介质的移动。 由于电泳支持介质上含有带电基团,主要是酸性 基团,如聚丙烯酰胺会在一定程度上脱氨化,琼 脂糖含有一定比例的硫酸基和羧基,这些固定的 带负电的基团会从缓冲液吸引带正电的反离子, 以保持系统的电中性。这些小的,高度水化的反 粒子是不完全固定的,它会偶然解离进溶液中, 随着电压梯度被带向阴极,直至被凝胶介质上的 下一带电基团所捕获。整体效果就是将液体从阳 极转运到阴极。
• 缩胶浓缩,再经分离胶分离,其中分离胶可以是 均一胶,也可以是梯度胶。均一胶中整块凝胶为 同一浓度,而梯度胶是由连续改变的浓度梯度组 成的,沿蛋白质迁移方向,浓度梯度逐渐增大, 凝胶孔径变小。
电泳的基本原理
电泳的基本原理电泳是一种常用的生物化学分离技术,它利用生物分子在电场中的迁移性差异来实现分离。
电泳技术广泛应用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在电泳过程中,样品中的生物大分子在电场作用下沿着凝胶或液相介质迁移,根据其迁移速度和迁移距离的差异来实现分离。
本文将介绍电泳的基本原理,包括电泳的原理、影响电泳的因素以及常见的电泳技术。
电泳的原理。
电泳的基本原理是利用生物大分子在电场中的迁移性差异来实现分离。
在电场作用下,带电的生物大分子会向电极迁移,迁移速度与其电荷大小、形状、分子大小等因素有关。
通常情况下,带负电的生物大分子向阳极迁移,带正电的生物大分子向阴极迁移。
在电泳过程中,样品中的生物大分子会在凝胶或液相介质中迁移,根据其迁移速度和迁移距离的差异来实现分离。
影响电泳的因素。
影响电泳的因素有很多,主要包括电场强度、凝胶或液相介质、pH值、温度等。
电场强度是影响电泳速度的重要因素,电场强度越大,生物大分子的迁移速度越快。
凝胶或液相介质的选择也会影响电泳分离的效果,不同的凝胶或液相介质对生物大分子的迁移特性有不同的影响。
此外,pH值和温度也会影响生物大分子的电泳迁移性,因此在进行电泳实验时需要对这些因素进行合理的控制。
常见的电泳技术。
常见的电泳技术包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分离技术,通过琼脂糖凝胶的孔隙大小来实现核酸的分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳则常用于蛋白质的分离,其孔隙大小可以根据需要进行调控。
毛细管电泳是一种高效的分离技术,其分离速度快、分辨率高,广泛应用于生物大分子的分离和分析。
总结。
电泳是一种重要的生物化学分离技术,利用生物大分子在电场中的迁移性差异来实现分离。
在电泳过程中,样品中的生物大分子会在凝胶或液相介质中迁移,根据其迁移速度和迁移距离的差异来实现分离。
影响电泳的因素包括电场强度、凝胶或液相介质、pH值、温度等。
常见的电泳技术包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等。
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术,通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术,它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质,通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构,可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小,从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠,它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中,将样品中的蛋白质经过SDS处理后,蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子,并且使蛋白质呈负电荷。
这样,所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度,可以消除蛋白质的本身的电荷特性,使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用,而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上,然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后,蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置,从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例,也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平,同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来,经过不断的改进和完善,在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来,随着科学技术的不断进步,SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展,并在更广泛的领域得到应用。
电泳技术(基础医学与医学实验技术)
电泳技术的应用领域
总结词
电泳技术广泛应用于生物、医学、化学等领域。
详细描述
电泳技术广泛应用于生物学、医学、化学和环境科学等 领域。在生物领域,电泳技术用于蛋白质、核酸和糖类 等生物大分子的分离和鉴定。在医学领域,电泳技术用 于血液、尿液和其他体液中蛋白质、酶和代谢产物的分 析。在化学领域,电泳技术用于合成高分子聚合物、金 属离子和有机化合物的分离和纯化。此外,毛细管电泳 和芯片电泳等新型电泳技术在生命科学和临床诊断等领 域也具有广泛的应用前景。
DNA电泳
DNA电泳是电泳技术中用于分离、鉴定和纯化DNA片段的一种方法。通过电泳技术可以将DNA片段按照大小进行分离,为基 因克隆、基因诊断和基因组学研究等领域提供基础。
DNA电泳的原理是利用DNA片段在电场中的迁移率不同而实现分离。DNA片段在电场中的迁移率取决于其大小、电荷和构象 等因素。通过选择合适的电泳介质和电泳条件,可以实现对DNA片段的精细分离。
电泳技术(基础医学与医学实验技 术)
contents
目录
• 电泳技术概述 • 电泳技术的基本类型 • 电泳技术在基础医学中的应用 • 电泳技术在医学实验技术中的应用 • 电泳技术的优缺点 • 电泳技术的发展趋势和未来展望
01 电泳技术概述
电泳技术的定义
总结词
电泳技术是一种利用电场对带电粒子进行分离的实验技术。
样品损失。
局限性
电泳技术对于某些特定类型的 生物大分子分离效果不佳,如 蛋白质的分离。
耗时长
电泳技术需要较长时间进行分 离,对于某些快速变化的生物 样品,可能无法及时检测。
高压电场影响
电泳过程中需要施加高压电场 ,可能会对生物大分子产生一 定的影响,如引起蛋白质的变
电泳教学
四.电泳的用途 电泳的用途
(1)分离各种有机物和无机盐 (2)分析某些物质的纯度 ) ) (3)分子量的测定 )
五.常用的电泳技术 常用的电泳技术
(一)醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。 醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。 广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中,如血清蛋白、 广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中,如血清蛋白、血红蛋 球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。 白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简 单快速等优点, 不影响样品的分离效果。 单快速等优点,电渗作用虽然较高但很均一 ,不影响样品的分离效果。不 足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低,由于薄膜厚度小( 足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低,由于薄膜厚度小(约10~ ~ 100µm),样品用量很少,不适于制备。 ),样品用量很少 ),样品用量很少,不适于制备。 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理: 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理:
显微电泳 电泳 自由界面电泳 区带电泳 一.基本原理 基本原理 二.影响电泳的主要因素 影响电泳的主要因素 1.电泳介质的 电泳介质的PH 电泳介质的 PH:决定解离度 Pr 、AA: PH距PI远 解离度大 电荷 PH距PI近 解离度小 电荷 V V 电荷量
选择合适PH:使电荷差异尽量大 PH值恒定:缓冲液 2.缓冲液的离子强度 缓冲液的离子强度 离子强度 离子强度 缓冲容量 压缩Pr双电层 不易维持PH恒定 电荷量 V
蛋白质组学分离技术-----双向电泳 双向电泳 蛋白质组学分离技术
1.某些物质的等电点或分子量相似。 某些物质的等电点或分子量相似。 某些物质的等电点或分子量相似 2.某些物质的等电点或分子量互补。 某些物质的等电点或分子量互补。 某些物质的等电点或分子量互补 A蛋白 电荷多 分子量大 蛋白:电荷多 蛋白 B蛋白 电荷少 分子量小 蛋白: 蛋白
电泳技术工作原理
电泳技术工作原理
电泳技术是一种在外加电场作用下,利用不同物质的电荷性质差异而实现物质分离的方法。
其工作原理可以简单概括如下:
1. 电荷性质差异:不同物质在溶液中具有不同的电荷性质。
根据溶液中溶质的电荷性质,可以分为带正电荷的阳离子和带负电荷的阴离子。
带电荷的物质可在电场中受到电场力的作用而运动。
2. 电场驱动:在电泳实验中,通过在电解槽中建立一个外加电场,将正负极电极分别连接到电源的正负极,形成一个电场。
这个电场会对带电荷的物质施加电场力,使其在溶液中移动。
3. 分离过程:在电泳实验中,将待分离物质(通常为带电荷的离子或分子)加入到含有电解质盐的缓冲液中,形成电泳液。
电泳液中的离子通过电场力的作用,在电泳槽中逐渐移动并分离出来。
4. 分离效果:由于不同物质在电场力的作用下移动速度不同,电泳液中的不同物质会在一定时间内到达不同位置。
根据不同物质到达的位置,可以通过对电泳槽进行适当的采集和分析,达到物质分离和提纯的目的。
总体而言,电泳技术利用外加电场对带电荷的物质施加电场力,使其在溶液中移动并分离出来,从而实现不同物质的分离、测定和分析。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽,加入电泳缓冲液, 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时,低电压(60~80V,起始电流不超过10~15mA), 进入分离胶后,提高电压(100~200V,电流不超过30mA),当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm,终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液,将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min;PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”:(膜可比滤纸稍大,防止短路) 提起滤纸平放在盒盖上,用洁净15ml离心管压走多 余的buffer,以不滴水为宜,平铺在半干转印槽上, 再将湿润的膜(实验室统一剪角标记)放在该层滤纸 上;接下来将已切角的胶平铺在膜上,在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链(H)和两条轻链(L)。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液(PH6.8)
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜:(半干转)(PVDF膜0.22UM) 半干转移中,一般恒流(1-1.5mA/cm2,60-90min),
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源,用镊子夹取PVDF膜,转移到塑料盒中,加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液,用TBST洗膜3次,每次5min 7、加入一抗,室温平缓摇动2h; 8、废弃液体用TBST洗膜3次,每次5min; 9、加入二抗,室温下孵育1h; 10、废弃液体用TBST洗膜3次,每次5min; 11、显色 在DAB中显色约10-30min,待蛋白质带的颜色
电泳仪仪工作原理
电泳仪仪工作原理
电泳仪的工作原理是利用电场对带电粒子(如离子、DNA片段、蛋白质等)进行分离和分析的一种技术。
其基本原理是运用电场的作用力将带电粒子移动到不同位置,从而达到分离的目的。
具体工作原理如下:
1. 电场建立:首先,在电泳仪中建立一个电场。
通常使用两电极,一个称为阳极(正极)、一个称为阴极(负极)。
两电极之间加上直流电压,形成电场。
2. 样品装载:将待分离的样品溶液装入电泳仪的电泳池中。
通常会将样品溶液加载在一个带电的孔(如凝胶内)上。
在电场的作用下,带电样品开始分离。
3. 电泳分离:带电样品在电场作用下,会受到电场力的作用而运动。
带正电的粒子向阴极方向运动,带负电的粒子向阳极方向运动。
根据带电粒子的大小、电荷量和形状的不同,它们会以不同速度运动。
带电粒子的速度和位置与其电荷量大小和空气摩擦力有关。
4. 分离结果测定:通过测定和记录经过一定时间后样品位置的移动情况,可以分析出不同粒子的运动速度和位置,从而得到粒子的分离结果。
常用的测定方法有凝胶电泳、毛细管电泳等。
总之,电泳仪的工作原理是通过建立电场、利用电场力使带电
粒子运动并分离,通过测定粒子的运动速度和位置获得分离结果。
这是一种常用的分离和分析技术,广泛应用于生物、化学、分子生物学等领域。
电泳技术的原理及其应用
电泳技术的原理及其应用1. 引言电泳技术是一种广泛应用于生物学、医学、药物研发和分析化学领域的分离和分析方法。
它基于物质在电场中的迁移速度差异,通过电化学原理将被分析物质分离出来。
本文将介绍电泳技术的原理以及一些常见的应用领域。
2. 电泳技术的原理电泳技术主要基于物质在电场中的迁移速度差异而实现分离。
通过施加电场,带电粒子或溶液中的分子会在电场中运动,而运动速度与其电荷、大小和形状有关。
电泳技术的原理可以归纳为以下几个方面:•电场作用:施加电场可以使带电粒子受到电荷作用力,从而在溶液中迁移。
•电泳介质:电泳介质通常是凝胶,如聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
它们通过限制溶液中溶质的扩散,使分子在凝胶中的运动主要受到电场力的影响。
•迁移速度差异:不同的分子在电场中的迁移速度差异主要由它们的电荷、大小和形状决定。
带有相同电荷的粒子,较大的粒子迁移速度较慢,较小的粒子迁移速度较快。
•检测方法:电泳技术常用的检测方法包括紫外光检测、荧光检测和放射性检测等。
这些方法可以用来检测分离出来的分子,并对其进行分析。
3. 电泳技术的应用电泳技术在生物学、医学、药物研发和分析化学等领域都有广泛的应用。
下面将介绍几个常见的应用领域:3.1 DNA测序DNA测序是电泳技术的一个重要应用领域。
通过电泳技术可以将DNA分子分离出来,根据DNA片段在电泳过程中的迁移速度差异,可以确定DNA序列。
这对于基因组研究、遗传变异分析和疾病诊断等都具有重要意义。
3.2 蛋白质分离与分析电泳技术也常用于蛋白质的分离和分析。
通过电泳技术可以将蛋白质分离出来,并根据其迁移速度差异进行分析。
这在生物学研究和药物研发中都非常常见。
3.3 药物研发电泳技术在药物研发中有着重要的应用。
通过电泳技术可以对药物进行分离和定量分析,从而评估药物的纯度、稳定性和活性等。
这对于药物研发过程中的质量控制非常关键。
3.4 环境分析电泳技术也被广泛应用于环境分析领域。
通过电泳技术可以对环境样品中的污染物进行分离和分析,对于环境监测和污染物治理具有重要意义。
电泳技术的原理和过程
电泳技术的原理和过程电泳技术是一种将带电的微粒或者溶解物通过电场力作用进行分离的方法。
它利用了带电粒子在电场中移动的性质,根据粒子的电荷量、大小和形状的不同,使其分离。
电泳技术的原理基于两个基本原理:电场力和迁移率。
1. 电场力:当带电粒子置于电场中时,电场力作用在粒子上。
这个电场力的大小与带电粒子的电荷量成正比,与电场强度成正比,反向与带电粒子的电荷极性一致。
电场力越大,粒子运动速度越快。
2. 迁移率:带电粒子在电场中的速度也受到其自身性质的影响,即带电粒子在电场中的迁移速率。
迁移率与带电粒子的电荷量、形状和大小有关。
一般来说,带电粒子的迁移率越大,移动速度越快。
基于以上原理,电泳技术的过程包括以下几个步骤:1. 准备样品:将希望分离的样品溶解在电泳缓冲液中,通常是一种带有电解质的缓冲液。
2. 准备电泳设备:将准备好的样品放置在电泳槽中。
槽中的电极接通电源,形成一个电场。
通常,阳极放在电泳槽的末端,而阴极则放在靠近样品的一端。
3. 操作电泳条件:设置适当的电场强度和时间,以保证带电粒子能够在合适的时间内得到分离。
强度太弱会导致分离时间过长,强度太大则可能会破坏分离过程。
4. 进行电泳:开启电源,使电场开始作用。
带电粒子在电场作用下迁移到相应的位置。
正电荷物质向阴极方向迁移,负电荷物质则向阳极方向迁移。
5. 结果分析:根据分离的结果,可以通过各种检测方法来确定目标物质的位置和含量,例如使用染色剂或者检测器。
总的来说,电泳技术通过利用电场力和迁移率的原理,将带电粒子分离开来,实现了分析和纯化的目的。
这种技术在生命科学、生物医学、环境分析等领域有着广泛的应用。
生物化学实验技术(5)电泳技术
3. 琼脂糖电泳应用
(1) 核苷酸琼脂糖电泳 (2) 血清脂蛋白电泳 (3) EcoR1对λDNA酶解片段分析
(三)聚丙烯酰胺凝胶电泳
优点: 可调节孔径大小,机械强度好,无电渗,分辨率高, 用途广。 一、基本原理 浓度 T%=(a+b)/m*100% 交联度 C%=b/(a+b) 聚合过程 AP-TEMED 核黄素-TEMED
2.分类及优点 电泳法可分为自由电泳(无支持体)及区带电泳 (有支持体)两大类。 自由电泳包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电 聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 区带电泳则包括滤纸电泳(常压及高压)、薄层电泳 (薄膜及薄板)、凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、 聚丙烯酰胺凝胶)等。 自由电泳法的发展并不迅速,因为其电泳仪构造复 杂、体积庞大,操作要求严格,价格昂贵等。而区带 电泳可用各种类型的物质作支持体,其应用比较广泛。 本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。
⒈琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢 键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束, 构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、 核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验 中常用于LDH(乳酸脱氢酶)、CK(肌酸激酶)等同 工酶的检测。
第二节 电泳分析常用方法
(一)醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素 醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。 这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸 电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较 小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由 样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量 少,5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适 合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液 处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描 测定和膜的长期保存。
电泳技术
电泳技术电泳技术,是一种常用于生物学和生物化学领域的实验分析方法。
它可以通过利用电泳原理,在凝胶或电泳片上将带电粒子在电场的作用下分离和测量。
电泳技术的应用非常广泛,包括蛋白质分析、核酸分析、分子筛选等。
本文将详细介绍电泳技术的基本原理、实验步骤和应用领域。
电泳技术的基本原理是利用带电粒子在电场作用下的迁移速度差异来实现粒子的分离。
根据粒子的性质和分离要求,可以选择不同的电泳介质和电泳条件。
常用的电泳介质有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺薄膜等。
电泳过程中,带电粒子在电场的作用下从供电极向阳极移动,移动速度与粒子的电荷量和大小有关。
通过调节电场强度和电泳时间,可以实现粒子的分离。
电泳技术在蛋白质分析中有着广泛的应用。
蛋白质是生物体内功能最为复杂的分子之一,其分离和分析对于研究生命科学起着重要的作用。
电泳技术可以将复杂的蛋白质混合物按照分子大小和电荷分离开来。
常用的蛋白质电泳方法有SDS-PAGE、二维电泳和等电聚焦等。
其中,SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法,通过使用带有表面活性剂SDS的凝胶,可以使蛋白质在电泳过程中按照分子大小分离。
核酸分析也是电泳技术的重要应用领域之一。
核酸是生物体内遗传信息的载体,对于研究基因结构和功能具有重要意义。
电泳技术可以将复杂的核酸样品按照碱基序列和长度进行分离和测量。
常用的核酸电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
琼脂糖凝胶电泳适用于分离较大的DNA和RNA分子,而聚丙烯酰胺凝胶电泳则适用于分离较小的DNA和RNA分子。
电泳技术还可以应用于分子筛选和分析。
基于电泳的分子筛选方法可以筛选出特定性质的分子,例如特异结合的抗体、酶和药物等。
通过调节筛选条件,可实现对不同性质和大小的分子进行分离和筛选。
这在药物研发和基因工程等领域有着广泛的应用。
综上所述,电泳技术是一种重要的实验分析方法,其基本原理是利用带电粒子在电场作用下的迁移速度差异来实现分离。
电泳的工作原理
电泳的工作原理
电泳是一种基于在电场中移动带电粒子的原理进行分离和测量的方法。
它利用物质的带电性质和电场的作用,使带电粒子在电场中发生迁移,从而实现样品分离和分析的目的。
电泳的工作原理可以分为三个主要步骤:
1. 准备电泳系统:首先,将待测样品(例如DNA、蛋白质等)溶解在缓冲液中,并注入电泳槽中。
接下来,在电泳槽的两端设置电极,在两端施加一个直流电场。
一端为阳极(正极),另一端为阴极(负极)。
2. 迁移过程:在电场的作用下,待测样品中的带电粒子开始在电泳槽中向相反极移动。
带电粒子的移动速度取决于其电荷大小、形状和电场的强度。
带电粒子越小、电荷越大,其移动速度越快。
因此,电泳可以实现对不同带电粒子的分离。
3. 分析结果:待测样品中的不同带电粒子按照其迁移速度的不同,逐渐分离并聚集在电泳槽中的不同位置。
根据特定的分析需求,可以通过染色剂或荧光标记等方法对待测样品进行标记,以便于可视化观察和分析。
总结来说,电泳通过施加一个电场,利用物质的带电特性,将待测样品中的带电粒子在电场中分离,进而实现对样品的分析和测量。
这种基于电场作用的分离方法在生物医药领域、环境监测等方面有着广泛的应用。
生化技术第十章 电泳技术
加速剂 —— TEMED(四甲基乙二胺)
四、分离原理
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统与不连续 系统两大类,
前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带 电颗粒在电场作用下,主要靠电荷及分子筛效应;
后者电泳体系中由于 缓冲液离子成分、pH、凝胶 浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动 不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,故 分离效果更好。
三. 电泳 不同蛋白质的区别只有分子量,因此电泳后可按分子量大小不 同而分离。但是测出的只是亚基的分子量。 为了得到蛋白质分子量,电泳时必须加标准蛋白(marker)一起电泳
分子量(MW)与迁移率(Rf)的关系: Lg MW =﹣bRf + k
式中:b、k均为常数 Rf
lg MW
第四节 等电聚焦凝胶电泳 (isoelectric focusing , IEF)
不连续PAGE
1. 电泳装置
+ H3C N
pH8.3
CH2OH tris -甘氨酸
CH2OH CH2OH
pH6.7
tris-HCl 缓冲液
三羟甲基氨 基甲烷(tris)
pH8.9
tris-HCl 缓冲液
pH8.3 tris -甘氨酸
(-)
电极缓冲液
样品 浓缩胶
(2.5% 大孔胶)
分离胶 (7.5% 小孔胶)
(-) (+)
(2)分子筛效应
大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受 阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 ,这就是分 子筛效应。
(3) 电荷效应 在pH8.9的分离胶中,各种带净电荷不同的蛋白质有 不同的迁移率。净电荷多,则迁移快; 反之,则慢。 因此,各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状, 以一定顺序排成一个个区带,因而称为区带电泳
电泳的基本原理
电泳的基本原理
带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳(electrophoresis,EP)。
利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。
根据分离原理不同,电泳可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳;根据电泳是在溶液中还是在固体支持物上进行,分为自由电泳和支持物电泳。
电泳的基本原理是:生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子,常以颗粒分散在溶液中,它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。
在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳。
电泳仪是实现电泳分析的仪器。
一般由电源、电泳槽、检测单元等组成。
主要用于对不同物质进行定性或定量分析,或将一定混合物进行组分分析或单个组分提取制备,应用于临床医学的实验室检验或科研实验研究。
常见的几种电泳仪有:全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪、全自动电泳分析系统。
电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。
电泳技术的基本原理
电泳技术的基本原理一、引言电泳技术是一种常用的生物分子分离和纯化方法。
它利用电场作用使带电的生物分子在凝胶或溶液中移动,从而实现不同大小、形状、电荷的生物分子的分离和纯化。
本文将介绍电泳技术的基本原理。
二、电泳技术的分类根据凝胶状态,电泳技术可以分为凝胶电泳和自由流体电泳两种。
其中,凝胶电泳主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺-琼脂糖混合凝胶电泳等;自由流体电泳主要包括毛细管电泳和等温点聚焦等。
三、凝胶电泳原理在凝胶中进行的凝胶电泳是最常见的一种。
其基本原理是利用凝胶孔径大小对待测样品进行筛选,使不同大小或形态的生物大分子在不同孔径范围内运动,达到分离目的。
1. 凝胶选择性不同类型的凝胶具有不同的孔径大小和选择性,比如聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小为1-100nm,而琼脂糖凝胶的孔径大小为10-1000nm。
因此,在进行凝胶电泳时需要根据待测生物分子的大小和形态选择合适的凝胶。
2. 生物分子带电生物分子在水溶液中通常带有电荷,可以是正电荷或负电荷。
这些带电生物分子在外加电场作用下会向相反方向移动。
3. 外加电场外加电场是实现凝胶电泳的关键因素。
一般来说,外加直流电场可以使带正电荷的生物大分子从阴极向阳极移动;而带负电荷的生物大分子则从阳极向阴极移动。
4. 速度与距离不同大小、形态、带电量的生物大分子在相同条件下运动速度不同,因此可以通过运动距离和时间来区别不同类型的生物大分子。
四、自由流体电泳原理自由流体电泳主要包括毛细管等温点聚焦等。
其基本原理是利用介质中pH值的梯度或离子浓度的梯度,使带电荷的生物分子在电场力和化学力的作用下向等温点聚焦。
1. 等温点等温点是指生物分子在介质中所处pH值下不带电荷的状态。
当生物分子处于等温点时,其净电荷为零,不受外界电场影响。
2. pH梯度利用pH值梯度可以实现等温点聚焦。
在pH梯度中,生物分子会向其等温点移动,并在移动过程中逐渐失去带电荷,最终停留在等温点处。
电泳技术的基本原理
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋 白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度 的快速、灵敏的方法。
垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头, 大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一 个带孔胶粒。
大分子
混合样品
电泳方向
电泳
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒,不 同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定,而长轴的 长度则与蛋白质分子量的大小成正比。
这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下,其迁移率便不再受 蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响,而主要取决于其 分子量大小这一因素。根据这一特点,就可以将各蛋白组分 按分子量大小分开。
➢ 带电物质在电场中向其所带电荷相反 的电极移动的现象称电泳。
➢ 电泳分离生物大分子的原理: 由于混合物中各组分所带电荷性质、 电荷数量以及分子量的不同,在同一 电场的作用下,它们泳动的方向和速 度也不同。因此,在一定时间内各组 分移动的距离不同,从而达到分离和 鉴定的目的。
影响迁移率的因素
在电场中,推动带电质点运动的力(F)等于质点 所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积。
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
分类
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续 系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶
浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠 电荷和分子筛效应。
不连续系统
• 不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH, 凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛 效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
电泳技术的基本原理
电泳技术的基本原理一、电泳技术简介电泳技术是一种常用的分离和分析生物分子的方法,广泛应用于生物学、生物化学、医学等领域。
它基于物质在电场中带电粒子的迁移速率与其电荷量和形状大小成正比的原理,通过电场作用下的迁移来实现分离和分析。
二、电泳的基本原理电泳技术的基本原理是利用电场作用下带电粒子的迁移来实现分离和分析。
在电场作用下,带电粒子会受到电场力的作用而迁移,迁移速率与电荷量和形状大小成正比。
电泳实验中通常使用凝胶或者溶液作为介质,通过调节电场强度和时间,可以实现不同带电粒子的分离和分析。
1. 凝胶电泳凝胶电泳是最常用的电泳技术之一,它利用凝胶作为分离介质。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等,通过调节凝胶的浓度和孔隙大小,可以实现对不同大小带电粒子的分离。
凝胶电泳通常分为水平电泳和垂直电泳两种方式,水平电泳适用于较短的DNA片段分离,而垂直电泳适用于较长的DNA片段分离。
2. 液相电泳液相电泳是另一种常用的电泳技术,它利用液相介质进行分离。
液相电泳可以分为毛细管电泳和高效液相色谱等多种形式,通过调节液相介质的性质和流动速度,可以实现对不同性质的带电粒子的分离和分析。
液相电泳通常具有分离效率高、分析速度快等优点。
三、电泳实验步骤电泳实验通常包括样品制备、样品加载、电泳操作等步骤。
下面以凝胶电泳为例,介绍电泳实验的基本步骤。
1. 样品制备样品制备是电泳实验的第一步,它包括DNA、蛋白质等生物分子的提取和纯化过程。
样品制备的好坏直接影响到电泳分离的效果,因此需要严格控制样品制备的条件和方法。
2. 准备凝胶凝胶的准备是电泳实验的关键步骤之一。
根据需要分离的生物分子大小,选择合适的凝胶类型和浓度。
凝胶通常需要在缓冲液中加热溶解,然后倒入电泳槽中,待凝胶完全凝固后即可进行下一步操作。
3. 样品加载样品加载是电泳实验的关键步骤之一,它决定了分离的效果。
样品需要与一定的缓冲液混合后,通过微量注射器或者吸管等工具加载到凝胶的孔隙中。
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SDS-PAGE的缺点
• 2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质 (如组蛋白F1),含有较大辅基的糖蛋白 和含有二硫键较多的蛋白质,以及一些结 构蛋白(如胶原蛋白)等,它们在SDS-凝 胶系统中,电泳的迁移率与分子量的对数 不呈线性关系。因此,为了测得真实和完 整的蛋白质分子量,通常可采用多种方法 进行测定和相互验证。
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋 白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓 度的快速、灵敏的方法。
垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头, 大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一 个带孔胶粒。
大分子
混合样品 电泳 电泳方向 带孔胶
小分子
按分子 大小分离
• 与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太 多,可以减少上样量。
琼脂糖凝胶电泳
实验原理1
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是 D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依 氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束,构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此 该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、 鉴定及纯化。
分类
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连 续系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及
凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主 要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统
• 不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH, 凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛 效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
marker的选择
• DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正 对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择 在目标片段大小附近ladder较密的,这样对目 标片段大小的估计才比较准确。需要注意的是 Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。 如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶 切Marker,需要预先65℃加热5min,冰上冷却 后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的 粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱 等现象。
电荷效应之三
在SDS-PAGE电泳中,由于SDS这种阴 离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成 复合物,使蛋白质分子带负电荷,这种负电 荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别, 从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别; 此外,由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后 都解离成亚单位,这是因为SDS破坏了蛋白 质氢键、疏水键等非共价键。
实验原理2
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加 电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效 应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及 构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出 不同的区带。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数 值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对 分子质量的DNA ,也可以分离相对分子质量 相同,但构型不同的DNA 分子。
浓缩胶
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小, 孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经 过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭 窄的区带。
分离胶
孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使 样品很好的分离.
浓缩效应之一
凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶,下层 为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液 (pH8.3),上层胶的缓冲液中加入PH=6.8的Tris-HCI,下 层中的缓冲液中Tris-HCI的PH=8.8。这样便形成了凝 胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几 乎全部解离为Cl-,但只有极少部分甘氨酸解离为 H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右,在 此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统 通电后,这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次 为Cl->蛋白质>H2NCH2COO-,故C1-称为快离子, 而H2NCH2COO- 称为慢离子。
结果处理
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下,
多肽链分子量的对数与
多肽链的相对迁移率成 线性关系,所以可以通 未 知 蛋 白
过标准曲线求未知多肽
链分子量。
相对迁移率
常见问题及处理办法
• 纹理和拖尾现象 • 由于样品溶解不佳引起的,克服的方法可 以在加样前离心,增加一 的关系
•
不同构型DNA的移动速度次序为:供价闭环 DNA(covalently closed circular, cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。 当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球 形)不能进入胶中,相对迁移率为0 (Rm=0),而同等大小的直线双链DNA(刚 性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0), 由此可见,这三种构型的相对迁移率主要 取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强 度、缓冲液离子强度等的影响。
凝胶的浓度
• 对于琼脂糖凝胶电泳,浓度通常在0.5~2% 之间,低浓度的用来进行大片段核酸的电 泳,高浓度的用来进行小片段分析。低浓 度胶易碎,小心操作和使用质量好的琼脂 糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分 子大小相近的DNA带不易分辨,造成条带缺 失现象。
缓冲液
• 常用的缓冲液有TAE和TBE,而TBE比TAE有
琼脂糖凝胶电泳技术
DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对 分子量质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。 • 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 • (1)DNA分子的大小 在凝胶中,DNA片段迁移距离 (迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的 标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可 测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时, 普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不 再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离 DNA时,分子大小不宜超过此值。 • (2)不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行 电泳分离。
着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓 冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓 冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上 升,缓冲性能下降,可能使DNA电泳产生条 带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
电压和温度
• 电泳时电压不应该超过20V/cm,电泳温度 应该低于30℃,对于巨大的DNA电泳,温度 应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温 度过高,可能导致出现条带模糊和不规则 的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能 导致小片段跑出胶而出现缺带现象。
两种电泳技术
优缺点
SDS-PAGE的优点
• • • • 设备简单 快速 分辨率和灵敏度高 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定 和分子量的测定
SDS-PAGE的缺点
1. 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽 链组成的(如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等), 他们在变性剂和强还原剂的作用下,解离成 亚基或单条肽链。因此,对于这一类的蛋白 质,SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单 条肽链的分子量,而不是完整蛋白质的分子 量。
带电物质在电场中向其所带电荷相反 的电极移动的现象称电泳。 电泳分离生物大分子的原理: 由于混合物中各组分所带电荷性质、 电荷数量以及分子量的不同,在同一 电场的作用下,它们泳动的方向和速 度也不同。因此,在一定时间内各组 分移动的距离不同,从而达到分离和 鉴定的目的。
影响迁移率的因素
在电场中,推动带电质点运动的力(F)等于质点 所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积。
F=EQ
质点的前移同样要受到阻力(f )的影响,对于 一个球形质点,服从Stoke定律,即:
(r为质点半径,η为缓冲液的粘滞系数,ν为质点移动速度)
f=6π r ην
其他因素:缓冲液pH、离子强度I、支持介
质的筛孔等。
★ SDS-PAGE凝胶电泳
★ 琼脂糖凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳
• 基本原理 • 分类 连续系统; 不连续系统:浓缩效应,电荷效应。 • 分离范围 • 上样缓冲液 • 常见问题及处理方法 • 优缺点
浓缩效应之二
电泳开始后,快离子在前,在它后面形成离子浓度 低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比,所 以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使 蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子 和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界 面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之 间,因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩 成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百 倍。
上样缓冲液之一
上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以 溴酚蓝为染料,5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样 缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。
本产品分为还原型和非还原型两种,还原型上 样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链 间二硫键断裂,使通过二硫键连接的各亚单位彼此 分离,在电泳凝胶上显现多个蛋白条带,选购和使 用时请务必注明,仔细区分。
琼脂糖凝胶电泳特点
电荷效应之一
样品进入分离胶后,慢离子甘氨酸全 部解离为负离子,泳动速率加快,很快超 过蛋白质,高电压梯度随即消失。此时蛋 白质在均一的外加电场下泳动,但由于蛋 白质分子所带的有效电荷不同,使得各种 蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。
电荷效应之二
与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化, 在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的 形状,使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受 蛋白质原有电荷与形状的影响。因此,各种 SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只 反映了蛋白质分子量的不同。
分离范围
• SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成SDS-蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰 胺~丙烯酰胺” 比率的增加而变小,比率接近 1:20 时孔 径达到最小值。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰 胺~丙烯酰胺”为1:29 配制,试验表明它能分离大小相 差只有3% 的蛋白质。