第1章 疏水层析
疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。
当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。
这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。
苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。
疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。
因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。
所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。
温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕ml)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。
材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖CL-4BNaCl硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。
1.装填5ml苯基琼脂糖CL-4B进入柱内；2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmol∕L,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。
上样总蛋白量200-500mg；4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5.用分步梯度法洗脱。
每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mol/LNaCl和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
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二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
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疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
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4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
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5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
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三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
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四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。
疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。
移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。
在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。
亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。
疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。
一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。
另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。
当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。
在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。
疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
疏水相互作用层析和反相层析
GE Healthcare疏水相互作用和反相层析技术原理和方法GE Healthcare生命科学产品使用手册目录简介 (9)第一章疏水相互作用层析的原理 ..............................................................................12理论情况下的疏水相互作用层析 ..............................................................................12水的作用 ............................................................................................................12蛋白结构 ............................................................................................................13可逆的相互作用 ...................................................................................................14疏水相互作用分离的步骤 .......................................................................................14分辨率 ...............................................................................................................17柱效 ..................................................................................................................18选择性 (19)第二章疏水相互作用的实践 ....................................................................................25简介 ..................................................................................................................25纯化策略（ CIPP ）中的疏水相互作用层析 ..................................................................25疏水相互作用分离的实际考虑 .................................................................................27筛选选择性 .........................................................................................................30自动的疏水相互作用填料筛选，方法开发和优化 .........................................................30手动介质筛选，方法开发和优化 ..............................................................................31样品性质和配基的选择 ..........................................................................................33盐的选择和缓冲液制备 ..........................................................................................33柱子和填料准备 ...................................................................................................38样品制备 ............................................................................................................38样品上样 ............................................................................................................39样品上样量 .........................................................................................................39样品体积 ............................................................................................................40温度 ..................................................................................................................40洗脱 ..................................................................................................................41线性梯度洗脱 ......................................................................................................41逐步洗脱 ............................................................................................................42流速 ..................................................................................................................35流速控制 ............................................................................................................44洗涤和再平衡 ......................................................................................................45分析结果和下一步 ................................................................................................45规模化放大 (46)疏水相互作用层析介质的保养 (47)问题解决 (47)理想的疏水相互作用分离：目的蛋白可以用梯度洗脱很好的分离 (47)目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差 (47)目的蛋白在梯度的末端洗脱，分辨率差 (48)目的蛋白在梯度的中间洗脱，分辨率差 (48)BioPress填料-专为生产设计的填料...........................................................................52客户定制的填料...................................................................................................52客户定制产品......................................................................................................52第3章疏水相互作用层析的介质..............................................................................53简介 (53)SOURCE：用高分辨率纯化和简单放大.....................................................................53纯化选项............................................................................................................54纯化案例............................................................................................................56进行一次分离......................................................................................................58第一次使用或长期储存后使用.................................................................................59用梯度洗脱分离...................................................................................................59用逐步洗脱分离...................................................................................................59清洗..................................................................................................................60填料性质............................................................................................................60化学稳定性.........................................................................................................61保存 (61)Sepharose High Performance：高分辨纯化 (61)纯化选择 (62)纯化案例 (64)进行一次分离 (65)第一次使用或长期储存后使用 (66)用梯度洗脱分离 (67)用逐步洗脱分离 (67)清洗 (67)填料性质 (68)化学稳定性 (69)保存 (69)Sepharose Fast Flow：用高分辨纯化，简单放大 (69)进行一次分离 (75)第一次使用或长期储存后使用 (76)用梯度洗脱分离 (77)用逐步洗脱分离 (77)清洗 (77)填料性质 (78)化学稳定性 (78)保存 (79)第四章纯化策略中的疏水相互作用层析 (79)应用CIPP (80)纯化技术的选择和组合 (80)疏水相互作用层析作为捕获步骤 (82)纯化重组人表皮生长因子（ h-EGF） (83)用于中度纯化的疏水相互作用层析 (84)纯化 Fab片段 (85)疏水相互作用层析作为精细纯化 (86)纯化重组的 Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PE553D (86)用作精细纯化的其它技术 (88)第五章反相层析：原理和方法 (89)简介 (89)术语 (92)反相层析理论 (90)反相层析分离的步骤 (91)分辨率 (93)选择性 (95)反相层析的实践 (103)填料和柱子选择 (103)洗脱液选择和准备 (104)柱子和填料准备 (107)样品制备 (107)样品上样量 (108)样品体积 (108)温度 (108)洗涤和再平衡 (110)问题解决 (110)基线漂移：平衡洗脱液 (110)纯化选项 C C2/C18:对复杂样品的高分辨分离............................................................... 113使用μRPC .........................................................................................................113分离案例.........................................................................................................114进行分离.........................................................................................................115第一次使用或长期储存后使用..............................................................................115用梯度洗脱分离................................................................................................115清洁...............................................................................................................116填料性质.........................................................................................................117化学稳定性......................................................................................................117储存 (117)SOURCE：快速高分辨分离，简单规模化放大……………………………………………………117纯化选项……………………………………………………………………………………………118纯化案例……………………………………………………………………………………………118进行分离……………………………………………………………………………………………121第一次使用或长期储存后使用……………………………………………………………………121用梯度洗脱分离……………………………………………………………………………………122清洗…………………………………………………………………………………………………122填料性质……………………………………………………………………………………………123化学稳定性…………………………………………………………………………………………124储存…………………………………………………………………………………………………124反相层析和CIP ………………………………………………………………………………………124反相层析作为捕获步骤……………………………………………………………………………125反相层析作为中度纯化……………………………………………………………………………125反相层析作为精细纯化……………………………………………………………………………125附录 1样品制备……………………………………………………………………………………126样品的稳定性………………………………………………………………………………………126样品净化……………………………………………………………………………………………127特定的样品制备步骤………………………………………………………………………………128蛋白沉淀的重新溶解………………………………………………………………………………131更换缓冲液和脱盐…………………………………………………………………………………132除去脂蛋白…………………………………………………………………………………………135除去酚红……………………………………………………………………………………………135除去小分子量杂质…………………………………………………………………………………135附录 2填充柱子填充和柱效 (137)附录 3选择纯化设备 (139)直线流速（ cm/h）和体积流速（ ml/min）之间的相互转换 (140)从直线速度（ cm/h）到体积流速（ ml/min） (140)从体积流速（ ml/min）到直线速度（ cm/h） (140)从ml/min到使用注射器.......................................................................................... 141附录4换算数据：蛋白、柱压.................................................................................141柱压...............................................................................................................141附录 5氨基酸表................................................................................................142附录 6纯化过程中的分析检测.............................................................................. 144附录 7生物样品的保存 (146)简介如图 1所示，根据生物分子的不同特性，可以用层析技术分离开。
疏水层析
生物大分子的分离与表征第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术A)疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。
从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。
非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。
疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。
最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。
最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。
最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 水部分是浅蓝色。
1.2、疏水层析原理A)B)高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。
疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。
在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。
盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基；◦ 高盐作用。
疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。
2-疏水层析 (HIC)课件
5-2、装柱
（1）、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好，将选择的层析柱垂直装好在台 式铁架上，关闭柱底部出口，在柱内注入少许（约1.0 cm高）洗脱液。
（2）、将烧杯中已处理好的Phenyl Sepharose凝胶，加适量的Buffer A，搅成 悬浮状，然后沿柱内壁细心的加至一定刻度。倒入时不要太快，以免产 生泡沫和气泡。
5-7、保存和打印实验结果
将实验结果保存到老师规定的文件中，同时打印实验结果 （结果见图1），并给出结论性的结果（见实验结果1）。
5-8、清洗仪器及相关装置
（1）、先从仪器装置中移去层析柱，并回收柱内Phenyl Sepharose凝胶，然后 用自来水冲洗层析柱，洗净后的层析柱再用蒸馏水荡洗一遍，方可。
四 试剂与配制
4-1、实验试剂
（1）、BSA （2）、苯基琼脂糖 （3）、磷酸氢二钠 （4）、磷酸二氢钠 （5）、硫 酸 铵 （6）、无水 乙醇
4-2、试剂配制
（1）、Buffer A（0.02 mol/L pH7.2磷酸缓冲液含1.0 mol/L硫酸氨）的配制： 分别称取Na2HPO4___ 克， NaH2PO4___克和[NH4 ]2SO4___ 克于一烧杯 中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。
（5）、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路”，节痕和气泡， 并 且柱床体表面平整而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤 (1-4)重新装柱直至达到要求为止。
（6）、在装柱的同时应将其他仪器设备接通电源，并按实验要求进行调试。
5-3、平衡
用5倍床体积的Buffer A缓冲液，以0.5 ml/min的流速，平衡30分钟，方可。
丁基疏水层析
丁基疏水层析
丁基疏水层析是一种层析技术，常用于化学分离和纯化的过程中。
它基于化合物在不同疏水性条件下的亲/疏水性差异，通
过溶剂的选择和控制来实现分离。
丁基疏水层析的原理是基于多相液体的分配平衡。
样品在两种液体相（一般是水和有机溶剂）之间分配，并根据其相对亲/
疏水性来决定在哪个相中停留。
疏水性较弱的化合物更容易溶解在有机溶剂中，而亲水性较强的化合物则更容易溶解在水相中。
在丁基疏水层析中，通常使用一个丁基（C4）疏水基团作为
固定相。
这个疏水基团可以与样品中的疏水性化合物相互作用，从而实现分离。
在分离过程中，样品先通过预处理步骤将目标化合物固定在丁基固相上，然后使用适当的洗脱剂洗脱出目标化合物。
洗脱剂一般为疏水性较弱的有机溶剂，可以根据目标化合物的亲/疏水性来选择。
丁基疏水层析具有简单、快速和高效的特点，广泛应用于化学、生物和制药领域的分离和纯化过程中。
它可以用于分离和纯化天然产物、蛋白质、多肽、核酸和其他有机物等。
蛋白质疏水层析原理
蛋白质疏水层析原理一、蛋白质疏水层析原理嘿，小伙伴们，今天咱们来唠唠蛋白质疏水层析原理这个超有趣的事儿。
蛋白质疏水层析呢，就是利用蛋白质表面的疏水区域和层析介质上的疏水基团之间的相互作用来实现分离的。
想象一下啊，就好像一群小动物，有些特别喜欢干燥的地方，有些就比较亲水。
蛋白质里那些有疏水区域的就像喜欢干燥的小动物，它们和层析介质上的疏水基团就特别容易“看对眼”，然后就结合在一起啦。
那这个原理在实际操作中是怎么体现的呢？咱们先从层析介质说起。
这些介质有各种各样的类型，它们的疏水基团的分布和性质都不太一样。
比如说有些介质的疏水基团比较多，有些就相对少一点。
当我们把含有蛋白质的混合溶液加到这个疏水层析柱里的时候，那些有较多疏水区域的蛋白质就会更快、更牢固地和介质上的疏水基团结合。
而那些疏水区域比较少的蛋白质呢，就没那么容易结合，可能就直接流过去了。
在这个过程中，还有一个很关键的因素就是洗脱液。
洗脱液就像是一个“调皮的小助手”。
我们可以通过改变洗脱液的成分，比如说改变它的盐浓度或者加入一些有机溶剂，来调节蛋白质和介质之间的相互作用。
如果我们增加盐浓度，就可能会让蛋白质和介质之间的结合变得更松散，这样就可以把结合在介质上的蛋白质慢慢地“拉下来”，按照它们和介质结合的紧密程度不同，一个一个地被洗脱下来，这样就实现了不同蛋白质的分离啦。
另外呢，蛋白质的结构也会影响它在疏水层析中的行为。
如果一个蛋白质的疏水区域在表面暴露得比较多，那它就很容易被层析介质捕捉到。
但是如果它的疏水区域被其他结构或者基团给遮盖住了，那它就没那么容易和介质结合啦。
反正就是说呢，蛋白质疏水层析原理就是一个充满了微观世界里各种奇妙相互作用的过程，就像一场小小的生物分子之间的“社交游戏”，通过它们之间的亲疏关系来达到分离的目的。
疏水层析名词解释
疏水层析名词解释
嘿，你知道啥是疏水层析不？疏水层析啊，就好比是一场特殊的“相亲大会”！那些具有疏水性质的分子们，就像是一群害羞的小伙子或者大姑娘，在这个特殊的场合里，寻找着自己的“另一半”。
比如说吧，蛋白质就是这场“相亲大会”里的主角之一。
它们有着不同的疏水区域，就像每个人都有自己独特的性格和魅力。
而疏水层析的柱子呢，就像是布置好的相亲场地，上面有着特定的疏水基团，专门吸引那些有疏水性质的分子。
想象一下，这些蛋白质分子在溶液中游走，当它们碰到疏水层析柱的时候，那些疏水区域就会被柱子上的疏水基团所吸引，就好像是两个人看对眼了一样，然后就结合在了一起。
而其他没有疏水性质或者疏水性质不强的分子呢，就像是那些没有找到合适对象的人，就继续在溶液中晃荡啦。
这时候呢，我们就可以通过改变一些条件，比如改变溶液的盐浓度或者酸碱度，来让结合在柱子上的蛋白质分子“松松手”，从柱子上下来。
这就好像是在“相亲大会”上，主持人稍微调整一下氛围，让那些已经结合的人也有机会重新考虑一下。
疏水层析在生物化学领域可是有着重要的作用呢！它可以帮助我们分离和纯化各种蛋白质、多肽等生物大分子。
哎呀呀，没有它可不行呢！
我觉得疏水层析就像是一个神奇的魔法棒，能把那些我们需要的分子从复杂的混合物中精准地挑出来，是不是超级厉害呀！它真的是生物化学研究中不可或缺的好帮手！。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析原理，也称为非极性层析原理，是一种分离和纯化化合物的常用方法。
该原理利用化合物在疏水性固定相（如疏水性硅胶）和溶剂中的亲水性差异来进行选择性分离。
在疏水层析中，化合物混合物首先通过一个填充有疏水性固定相的柱子（如硅胶柱）；然后用一个选择性的溶剂进行洗脱，使得各种化合物可以以不同的速度从柱中流出。
疏水性固定相作为分离介质，最主要的特点是表面疏水性强，与非极性或疏水性化合物具有较好的相互作用能力。
这种相互作用可以通过范德华力、氢键等进行，使得疏水性化合物被相互作用力留在柱上。
而亲水性化合物则更容易与溶剂发生作用而从柱中洗脱。
在进行疏水层析时，溶剂的选择是非常重要的。
选择的溶剂应该足够强大，可以与疏水性化合物发生相互作用，从而实现其分离。
常用的溶剂包括乙腈、甲酸乙酯、异丙醇等。
总之，疏水层析原理是通过利用化合物在疏水性固定相和溶剂中的亲水性差异，实现化合物的选择性分离。
这种方法在分析化学和生物化学等领域中广泛应用，能够有效地纯化和分离化合物。
疏水层析
2011~2012年度第一学期《酶工程与蛋白质工程》作业姓名：蔺重阳班级：10生物技术专升本2班学号：1006703232疏水层析一.原理：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。
二.性质：是利用分离介质中固定的疏水配位体和被分离的蛋白质的疏水表面区域之间的相互作用进行的分离方法。
疏水相互作用力的大小随引入烃链的延长而不断增加，从而能将欲纯化的蛋白质有效地分离开来。
三应用实例：纯化鸡胗钙调蛋白取新鲜鸡胗(除去结缔组织)切成1cm3小块，置组织捣碎机中，加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol／L Tris-HCl，pH8.0，2mmol ／L EDTA，1mmol／Lα-巯基乙醇)高速匀浆三次(30s／次)，离心(8000 r／min，4℃，0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重复抽提一次)，合并抽提液，加硫酸铵盐析(pH8.0，60％饱和度)，除去大量杂蛋白，上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0)，离心收集含有效成分的沉淀物，加蒸馏水悬浮，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0，令其缓慢溶解，经透析，离心得到溶液上阴离子DEAE-Sephadex A50层析柱(pH8.0)（离子交换层析），用梯度缓冲液(10mmol／Ltris-HCl，pH8.0-0.2mol／L NaCl-1mmol／L EDTA-1mmol／L α-巯基乙醇，盐浓度变化范围为0.2~0.7mol／L NaCl)洗脱，通过分部收集和活性测定，合并有效成分溶液进行疏水层析。
此层析用的固定相为苯基-Sepharose CL-4B，用其纯化钙调蛋白的流程见图4-1。
疏 水 层 析
7、 柱子的预平衡：10倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵（这个浓度要你选择，50%还是30%？）），使其平衡。
8、 上样：当平衡层析缓冲液流至恰好与床面相切时，关闭出液口（有泵的话，把它一关就OK!），然后上样。注意：尽量小心，保持床面的平整性！打开出口，让样品缓缓进入柱床，再次相切时，加入少量（很少就可以，稍稍盖过床面就行！）层析缓冲液（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗一下。
2、 柱子的装填：如果是预装柱，就不存在装柱的问题了。不是，则从头开始：首先，把柱子洗干净，一定要洗干净，不然会出现气泡。填料预先融涨（注意，进口一般已经是融涨好的，不必再做这一步），取一定的填料（例如：想装5.0ml的柱子，一般将瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的话）取10.0ml出来）先脱一下气（请人帮忙，不然控制不好会暴沸出来！），然后缓缓装入柱子（柱子上下口一定不要搞错！！！），打开下口让水流出，最好一次性装完，等待其自然沉降，柱子就装好了。（实际上，因为疏水层析的原理与分子筛不同，所以其装柱远远没有分子筛的柱子那么严格，很容易的！放心好了！看着顺眼就应该差不多吧）
13、 好了，就这么多，有什么问题再讨论吧。或者到丁香园去问一下，chromatography很内行的！
疏 水 层 析
1、 疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。在高盐离子强度的情况下，蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用，从而结合在柱子上。不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。随后，逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来，形成一个个的蛋白质洗脱峰。
3、 注意：柱子装好之后，任何时间都不能让缓冲液流到柱面以下而干柱，切记！
疏水层析洗脱条件
疏水层析洗脱条件
疏水层析是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于生物制药、食品工业、环境监测等领域。
在疏水层析过程中，洗脱条件的选择对于分离效果和纯化程
度至关重要。
以下是几个影响疏水层析洗脱条件的关键因素：
1.洗脱缓冲液的pH值：pH值对于洗脱物质的电荷状态和分配系数有着重
要影响。
根据目标物质的酸碱性质选择合适的洗脱缓冲液pH值，可以有
效地调节目标物质的亲和性。
2.洗脱缓冲液的离子浓度：离子浓度会影响洗脱物质与固定相之间的竞争
关系，进而影响洗脱效果。
根据目标物质的亲和性选择合适的离子浓度，
可以优化分离效果。
3.洗脱缓冲液的洗脱剂浓度：洗脱剂浓度高低直接影响洗脱效果。
过低的
洗脱剂浓度可能导致目标物质无法有效洗脱出来，而过高的浓度则可能
导致非特异性洗脱。
需要根据具体情况进行调节。
4.洗脱流速：洗脱流速对于洗脱效果和纯化程度也有一定影响。
过高的流
速可能导致目标物质被冲刷出来，而过低的流速则可能导致洗脱效果不
理想。
需要根据具体情况选择合适的洗脱流速。
综上所述，选择合适的疏水层析洗脱条件是确保分离效果和纯化程度的关键。
通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度、洗脱剂浓度以及洗脱流速，可以优化疏水层析的洗脱效果。
蛋白质的疏水作用层析
第二部分 药学生化实验实验一. 疏水作用层析【实验目的】通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
【实验原理】疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 结构示意图如下。
O CH 2CH CH 2OOH【实验材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm ）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计 2．实验试剂（1）疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow （2）溶液A ：0.1M Na 2HPO 4, pH7.0+WP ：固相支持物 L ：疏水性配体S ：蛋白质或多肽等生物大分子 H ：疏水补丁 W ：溶液中水分子P（3）溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4（4）蛋白质样品溶于溶液B【实验操作】1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
《疏水层析7组》课件
疏水层析的优势与局限性
• 广泛应用：疏水层析在蛋白质纯化、蛋白质相互作用研究 、蛋白质结晶等领域具有广泛的应用。
疏水层析的优势与局限性
1 2
对非疏水蛋白质的分离效果不佳
由于疏水层析主要依赖于蛋白质的疏水性质进行 分离，因此对于非疏水蛋白质的分离效果可能不 佳。
对缓冲液的要求较高
为了获得最佳的分离效果，需要选择合适的缓冲 液，这可能会增加实验成本和时间。
平衡条件
确保柱子在分离前处于平衡状态 ，以提高分离效果。
上样溶液的准备
根据分离目标，准备适当浓度的 上样溶液。
上样方式
采用适当的上样方式，如直接上 样、分流上样等，以确保样品能
够均匀分布在柱子上。
疏水层析的洗脱与分离
洗脱液的选择
选择适当的洗脱液，以逐步洗脱不同亲和力的组 分。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如梯度洗脱、脉冲洗脱等 ，以提高分离效果。
在体内的药效和代谢特性。
此外，疏水层析技术还可用于疫 苗的制备和病毒的分离纯化，为 生物医药领域的研究和应用提供
了有力支持。
在环境科学领域的应用
随着环境问题的日益严重，疏水层析技 术在环境科学领域的应用也逐渐受到关
注。
该技术可用于土壤和水体中有机污染物 的分离和富集，以及有毒有害物质的检
测和分析。
操作条件的优化与改进
优化流动相组成
通过调整流动相的pH值、离子强 度和有机溶剂含量等参数，改善 目标蛋白的吸附和洗脱效果。
温度控制
研究温度对疏水层析的影响，通 过调节温度提高分离效果和蛋白 质的稳定性。
联用技术与其他分离方法的结合
串联层析
将疏水层析与其他分离方法（如离子交换层析、亲和层析等）串联使用，实现 多级分离纯化，提高目标蛋白的纯度。
疏水层析
蛋 白 质 结 合 容 量 （ mg/ ml 凝 胶 床）
洗脱的方式：
（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱 （最常用） （2）通过往流动相中添加有机溶剂 ，如： 乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极 性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质） （3）往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本 身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在 其上的目标组分置换下来 （分离膜蛋白）
温度升高会增加疏水作用，但注意蛋 白质等生物大分子在较高温度下会变性。 对特定的分离，操作温度需保持恒定，才 能确保层析结果具良好的重复性。
层析介质的再生、贮存
再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强 的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质 上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶 液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析 柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的 效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的 清洗剂 贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶 液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂， 以防止微生物的生长
Hydrophobic Interaction Chromatography HIC
疏水作用层析
原理 介质 技术
概述
疏水层析分离的概念早在1948年由Tiselius 提出，真正发展是1970年开发出一系列适合 疏水层析的固定相以后； 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或 凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经 常联合使用来分离复杂的生物样品；
一般来说每个分子被吸附的过程 都会有一个以上的配基参与，换句话 说，分子在介质上发生的结合是多点 结合.
疏水层析与反相层析的区别 ：
RPC介质上疏水配基的取代程度大 大高于HIC介质，RPC更适合在水-有机 溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分 子蛋白质的分离纯化； HIC过程洗脱条件温和，通常降低 洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白 质的纯化中有较广泛的应用。
疏水层析原理
疏水层析原理疏水层析是一种常用的分离技术，它利用样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异，实现对混合物中成分的分离和纯化。
疏水层析原理是基于样品成分在疏水固定相和流动相之间的亲疏水性差异而建立的，下面将详细介绍疏水层析原理及其应用。
首先，疏水层析原理的核心是疏水作用。
疏水作用是指非极性物质在水相中受到排斥的倾向，因此在含有疏水基团的分子中，分子内部的疏水基团之间会发生疏水相互作用，使得分子趋向于聚集在一起形成疏水相。
而在疏水固定相中，也存在着疏水基团，因此样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异就是基于这种疏水作用而产生的。
其次，疏水层析原理的应用非常广泛。
疏水层析技术在生物化学、生物医药、环境监测等领域都有着重要的应用。
例如在蛋白质纯化过程中，疏水层析可以利用蛋白质分子中的疏水氨基酸残基与疏水固定相之间的相互作用，实现对蛋白质的分离和纯化。
在药物分析领域，疏水层析也常用于药物的提取和分离，通过调节流动相的成分和流速，实现对复杂混合物中药物的有效分离。
此外，疏水层析原理还可以与其他分离技术相结合，发挥更大的作用。
例如与离子交换层析、亲和层析等技术结合，可以实现对复杂混合物中成分的更精确分离和纯化。
同时，疏水层析也可以与质谱联用，实现对样品成分的快速鉴定和定量分析。
总之，疏水层析原理是一种重要的分离技术，它利用样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异，实现对混合物中成分的分离和纯化。
疏水层析技术在生物化学、生物医药、环境监测等领域有着广泛的应用，而且可以与其他分离技术相结合，发挥更大的作用。
通过对疏水层析原理的深入理解和应用，可以为科研工作者和工程技术人员提供更多的选择和可能性。
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生物大分子的分离与表征第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第3章 色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章 重组蛋白的分离与分析 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术A)疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 与流动相中的 些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。
合而进行分离的层析技术 从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。
(H d h bi it ) 非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。
疏水作用(hydrophobic interaction): 非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 聚集在 起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。
最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。
热动力学折衷的结果就球形蛋白质的结构而言， 其分子中的疏水性残基数是从 外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包 埋在球形蛋白内部，有些则暴 露在外，在蛋白质表面形成疏 露在外 在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。
最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。
最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 分 在 蓝色的 少的亲 水部分是浅蓝色。
1.2、疏水层析原理A) ) B) )高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。
疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。
在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。
盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic 靠蛋白质表面的 些疏水补丁(hydrophobic patch)； ◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基； ◦ 高盐作用 疏水层析的特性所致 即在高盐浓度 高盐作用。
疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下 暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。
一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质 ，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固 定相结合在一起。
然后通过降低流动相的离子强度，即可将结 合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进 行解吸附。
❝也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用盐溶液洗脱时，会先被洗下来。
当盐溶液浓高浓度盐溶液洗脱时会先被洗下来。
当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。
（相同盐浓度下疏水作用弱的物质先被洗下来（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下来）❝对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量的目的有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。
1.3、疏水层析介质疏水层析介质由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。
基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。
其合成聚合物类如聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯类其中，琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。
HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。
代表疏水配基，M代表基质。
调节两种R代表疏水配基代表基质调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度偶联至基质的常见配基类型（A）丁基（B）辛基（C）苯基（D）新戊基（）新戊基对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。
1.Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50μmol 正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。
2. Octyl Sepharose 4 Fast Flowy p 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol 正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。
⒊Phenyl Sepharose 6 Fast Flow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml 40 μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，1.4、疏水层析实验技术14疏水层析实验技术一、层析柱的制备1、层析介质选择配基的性质与密度对决定疏水相互作用层析介质最终的选择性、结合能力起到重要的作用。
配基的种类和目的蛋白的性质在确定疏水相互作用层析的选择性方面是高度显著的参数。
最合适的配基必著的参数最合适的配基必须通过用目的蛋白进行筛选试验来确定。
图21 在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗体相互作用不同。
总的来说，疏水相互作用填料可以根据它们和样品组分的相互作用分为两类。
直链烷基（丁基，辛基，醚基，异丙基）显示一个纯的疏水性质，而芳香基配基（苯基）显示混合型而性质，包括芳香性和疏水性相互作用。
在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)-Sepharose CL-4B吸附剂作固定相基(或辛基)p吸附剂作固定相。
2、层析柱的选择❝柱床高度通常为5～15cm。
❝粗柱子（内径为1.6 ～5.0cm）适合进行HIC层析。
3、装柱将选定的亲水性吸附剂如苯基S h❝将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose Cl-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间；❝采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物；❝并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中；尔后按常规方法装入层析柱经洗涤平❝尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。
❝在疏水相互作用层析中，结合过程比洗脱过程更具有选择性所以优化起始缓冲液的程更具有选择性。
所以，优化起始缓冲液的条件很重要。
正确选择的盐种类和浓度是影响载量和最终选择性的最重要参数响载量和最终选择性的最重要参数。
❝往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐，往平衡的缓液样中加种，有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。
随着盐浓度的提高结合到固定化配基上的❝随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量也相应提高。
在实践中钠或铵的硫酸盐有效的促在实践中，钠、或铵的硫酸盐有效的促进在疏水相互作用层析中配基-蛋白相互作用，在蛋白质结构上有稳定作用。
因此最常用的盐因此，最常用的盐：Na2SO4、NaCl和(NH)SO4。
42 4图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。
❝在给定的浓度下，和其它的盐相比，硫酸铵能够给出最好的分辨率，但在pH高于铵能够给出最好的分辨率但在8.0的情况下不推荐使用。
硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在❝硫酸钠是种非常好的盐析试剂，但是在高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍它的应用。
如的分洗脱得太晚或本洗脱或者能❝如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱，或者不能更换到不同的填料，尝试使用50%的盐浓度结合。
❝有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。
起始缓冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中的沉淀。
盐浓度降低避免在行中的淀图23 起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。
作择液离并致❝对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致关重要。
最经常使用磷酸缓冲液。
❝pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。
❝然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。
终择辨响常的增加减弱疏水相互作用在85❝pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。
添加剂可以用来改善选择性和分辨率。
例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧时。
然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋白失活或/和变如果在高浓度使用就有使目的蛋白失活或性的可能。
添加剂可以通过促进蛋白溶解性，改变蛋白构象，促进结合着的蛋白的洗脱来影响分离。
水溶性醇、去垢剂等是疏水相互作用层析中最广泛使用的添加剂。
四、层析步骤平衡↓上样↓平衡除杂↓洗脱1. Equilibration2Sample applicationWater molecules 2. Sample application 3. Washing4. ElutionWater molecules Hydrophobic ligandGel matrixEquilibrate the columnand adjust the sampleto binding conditions to binding conditions1. Equilibration2. Sample application3.Washing4. Elution Gel matrix1. Equilibration2. Sample application Non-bound proteins p pp3. Washing4. Elution Absilib i1. Equilibration2. Sample application1E ilib 1. Equilibration 2. Sample application3Washing 3. Washing在进行任何疏水相互作用层析前，需确定样品的“盐稳定范围”。
比如，加入逐步增加的盐至粗提物比如加入逐步增加的盐至粗提物中，用来确定蛋白沉淀发生的浓度。
确认样品在上样到柱子时低于该盐浓度，以避免沉淀。
样品制备建立盐溶解性范围后从最高的能够保❝样品制备：建立盐溶解性范围后，从最高的能够保持生物学活力而不发生沉淀问题的盐浓度开始。
调节样品到起始缓冲液的盐浓度来促进疏水相互作用。
使用高浓度的储液调节盐浓度，以避免由于加入固体盐时局部盐浓度过高而造成沉淀。
直接调节样固体盐时局部盐浓度过高而造成沉淀品的pH。
由于疏水相互作用对pH不是非常敏感，不需要完全的缓冲液交换不需要完全的缓冲液交换。
❝在上样前用简单的步骤净化所有的样品，这样可以避免堵柱子的风险减少强力清洗步骤的需要避避免堵柱子的风险，减少强力清洗步骤的需要，避免柱子性能的破坏和柱压的增加。