第1章 疏水层析

生物大分子的分离与表征
第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第3章 色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章 重组蛋白的分离与分析 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术

A)

疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 与流动相中的 些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。 合而进行分离的层析技术 从作用机制来看，它属于吸附层析。

非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。 (H d h bi it ) 非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。

疏水作用(hydrophobic interaction): 非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 聚集在 起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。

对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。 热动力学折衷的结果

就球形蛋白质的结构而言， 其分子中的疏水性残基数是从 外向内逐步增加的。 虽然疏水氨基酸大多被包 埋在球形蛋白内部，有些则暴 露在外，在蛋白质表面形成疏 露在外 在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。 最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 分 在 蓝色的 少的亲 水部分是浅蓝色。

1.2、疏水层析原理
A) ) B) )
高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。 疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。 在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。


亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理
◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic 靠蛋白质表面的 些疏水补丁(hydrophobic patch)； ◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基； ◦ 高盐作用 疏水层析的特性所致 即在高盐浓度 高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下 暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。

一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质 ，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固 定相结合在一起。 然后通过降低流动相的离子强度，即可将结 合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进 行解吸附。

❝也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用

盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐溶液浓高浓度盐溶液洗脱时会先被洗下来。当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。（相同盐浓度下疏水作用弱的物质先被洗下来（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下来）

❝对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量

的目的

有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。

1.3、疏水层析介质

疏水层析介质由基质和配体(疏水性基团)两

部分构成。

基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工

合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其合成聚合物类如聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯类其

中，琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。

HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。

代表疏水配基，M代表基质。调节两种

R代表疏水配基代表基质调节两种

反应物的比例可控制介质的配基密度

偶联至基质的常见配基类型

（A）丁基

（B）辛基

（C）苯基

（D）新戊基

（）新戊基

对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。

1.Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50μmol 正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。

2. Octyl Sepharose 4 Fast Flow

y p 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol 正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。

⒊Phenyl Sepharose 6 Fast Flow

工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml 40 μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，

1.4、疏水层析实验技术

14疏水层析实验技术

一、层析柱的制备

1、层析介质选择

配基的性质与密度对决定疏水相互作用层析介质最终的选择性、结合能力起到重要的作用。

配基的种类和目的蛋白

的性质在确定疏水相互作用

层析的选择性方面是高度显

著的参数。最合适的配基必

著的参数最合适的配基必

须通过用目的蛋白进行筛选

试验来确定。

图21 在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗体相互作用不同。