基因工程第二章基因克隆所需的工具酶

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基因工程中常用的三种工具酶

基因工程中常用的三种工具酶

一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)1.定义:凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶,也称为限制酶(restriction enzyme,RE)。

2.类型:来自原核生物,有三种类型。

Ⅰ型:兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性,随机切割。

Ⅱ型:大多能特异识别4~6个核苷酸序列(回文结构),最大识别序列为8个核苷酸,如SfiI、NotI;但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构,如SfaNI、MnlI等,Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。

另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列,将这类酶特称为同工异源酶(isoschizomers)或同裂酶。

同工异源酶切割产生相同的末端;有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别,故可用来研究DNA 甲基化作用,如SmaI和XmaI;HpaII和MspI;MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶;其中HpaII和MspI是一对同工异源酶,其识别位点是CCGG。

与同工异源酶对应的一类限制酶,它们虽然来源各异,识别序列也各不相同,但都产生出相同的粘性末端,称为同尾酶(isocaudamers)。

常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶,它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

显而易见,由同尾酶所产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的,因此在基因克隆实验中很有用处。

但必须指出,由两种同尾酶消化产生的粘性末端,重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型:功能基本同Ⅰ型,但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示:Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定(于识别序列前后100~1000bp范围之内)特定(切割于识别序列之中或近处,固定位点)特定(切割点在识别序列后25~75bp处)与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3.命名:第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第四个字母代表株。

基因工程的工具酶

基因工程的工具酶
稳定性
03
应用领域:基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势:定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向,推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用:作为构建基因电路的关键元件,实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势:更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景:利用工具酶进行药物设计和生产,提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景:利用工具酶进行污染治理和生态修复,保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗:工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学:工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展:工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望:工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用:基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能:连接 DNA片段,形 成重组DNA
特点:高效、 特异性强、稳 定性好
应用:基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型:T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能:在基因工程中,聚合酶用于切割和连 接DNA,以实现基因的插入、删除和修改
工具酶:基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用:在基因突变的研究中,
实例:例如,使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA,然后使用DNA连

基因工程基因工程工具酶

基因工程基因工程工具酶

基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。

在基因工程的过程中,基因工程工具酶发挥着关键的作用。

本文将介绍几种常用的基因工程工具酶,包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶(Restriction Enzyme)是一类具有特异性切割DNA双链的酶。

它可以识别并切割DNA的特定序列,通常这个序列是对称的,在切割后会产生特定的片段。

1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。

它们通常识别的序列是4到8个碱基对长,具有一定的对称性。

一旦内切酶与特定序列结合,它会切断DNA的链,在特定的位置形成断裂,从而将DNA切割成特定的片段。

1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。

它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。

通过选择适当的限制性内切酶,可以对DNA进行特定的切割和连接,从而实现对目标基因的定向操作。

二、连接酶2.1 定义连接酶(Ligase)是一种酶类,能够将两条DNA片段连接起来。

在基因工程中,连接酶通常被用于连接目标基因和载体。

2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。

它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起,形成一个新的DNA分子。

2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。

它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。

通过连接酶的作用,可以将多个DNA片段连接起来,构建出符合需要的重组DNA分子。

三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。

在基因工程中,修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。

3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。

它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。

3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。

它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。

基因工程常用的工具酶

基因工程常用的工具酶

四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度: 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度:
反应温度:
DNA的分子结构:
酶缓冲液组成: 甘油浓度:
MgCl2: NaCl/KCl: Tris-HCl: β-巯基乙醇/二硫苏糖醇(DTT): 牛血清白蛋白(BSA):
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA:
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA:
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶(T4连接酶) 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶:能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
与识别位点一致 Mg2+


EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母(大写)和种名前两字母(小 写)表示寄主物种

基因工程-工具酶

基因工程-工具酶

基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中,实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基, 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶,开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用,用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学,工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具,用于切割、连接和修饰DNA分子,使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列,用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起,构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰,如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列,如聚合酶链反应(PCR)中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用,识别并结合到目标序列上,然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因,使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵,生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制:某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题:基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑:对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管:基因工程面临严格的法律和监管要求。

基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶

基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
2010-11-8 苏州科技学院生物系 叶亚新
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下,限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化,结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点, 得到不同的酶切片断,这就是限制酶的 星号活性( activity) 星号活性(star activity) EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁,转化,核酸纯化,检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四.限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别4 1)识别4-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN; NGATCN;AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC; GGATCC;PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC; GCGGCCGC; SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -GGATG(N)9-3’ 5’-GGATG( )93’-CCTAC(N)13-5’ 外侧,产生5’-端突 -CCTAC( )13- 外侧,产生5 起 富含GC 2)富含GC

第二章 分子克隆工具酶

第二章 分子克隆工具酶

2 分子克隆工具酶(4学时)概述限制性内切核酸酶甲基化酶(Methylase)DNA聚合酶(DNA polymerase Ⅰ)其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

o基因工程的操作,是在分子水平上的操作,是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶,连接酶,DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割,拼接和扩增等操作。

所以把这些酶称之为“工具酶”。

o工具酶是对野生菌株(或真核生物如酵母)进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。

这些酶类参与微生物的核酸代谢,在核酸复制和修复等反应中具有重要作用,有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。

o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。

常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰(Restriction and modification)o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱(Site preference)o酶切反应条件o星星活性(star activity)o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ(k )】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象:2.1.1 限制与修饰(Restriction and modification )E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。

表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现,寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。

分子克隆技术常用的工具酶

分子克隆技术常用的工具酶
经修饰的DNA不再被限制酶降解。
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M.EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种:
①敏感的,甲基化后不能再切割;
DNA用的乙醇。
2)甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后,会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为:m4C表示N4-甲基化胞嘧啶,m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3)底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网,至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种;其中Ⅱ类酶有3845种.
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等, 一般将限制酶分为I,Ⅱ,Ⅲ 三大类。
②不敏感的.甲基化后仍可切割;
③依赖于甲基化的,只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 )DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2)核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程

基因工程常用工具酶及应用

基因工程常用工具酶及应用

DNA 连接酶
36
DNA连接酶
连接的部位:磷酸二酯键(梯子的扶手), 不是氢键(梯子的踏板)。
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三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛,如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶,在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
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四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA,形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
14
四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸,如
EcoRI,HindIII,BamHI,居多数。 也有少数限制性内切酶,识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上,当识别序列核 苷酸数为单数时,则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC(N 代表四种核苷酸)。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成,构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点, 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种,可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程;
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• 一般说来,在DNA分子中,识别序列短的 出现概率大,识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A,则间隔256 (4×4×4×4)个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I,则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。

第二章 分子克隆工具酶题目

第二章 分子克隆工具酶题目

第二章分子克隆工具酶一、选择题1.有关基因工程的叙述正确的是()A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点,Hind Ⅲ有7个切点。

调整这些酶切位点的数量,主要通过()。

A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切二、填空题1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5‟突出的黏性末端,则可以用__________进行3‟末端标记。

如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3‟突出的黏性末端,可以用__________________ 进行3‟末端标记。

2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记,因为这种酶具有____________和_______的活性。

三、判断题1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段,留下了ampR和tetR的完整片段。

pBR327比pBR322有更高的拷贝,每个细胞中含有30-45个拷贝。

同时pBR327具有接合能力,能直接转入其他细胞()四、名词解释1. DNA聚合酶2. 限制性内切酶3. 甲基化酶4. T4-DNA连接酶5. 核酸酶6. Klenow酶7. T4 DNA聚合酶8. Taq DNA聚合酶9. 逆转录酶10. 同裂酶11. 核酶五、简答题1.限制性内切酶分为哪几大类,各有什么特点?2. DNA修饰酶主要有哪些,各有什么作用?3.简述Klenow聚合酶的用途。

4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。

5.限制性内切酶I 的识别序列和切点是——GATCC G ↓,限制性内切酶II 的识别序列和切点是——GATC ↓。

在质粒上有酶I 的1个切点,在目的基因的两侧各有l 个酶II 的切点。

用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA 。

《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单

《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单

《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一,为人类带来了前所未有的机遇和挑战。

而在基因工程中,酶和载体是至关重要的工具,它们就像是工匠手中的精巧工具,帮助我们实现对基因的精确操作和转移。

一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶,也被称为“分子剪刀”,是基因工程中最重要的工具酶之一。

它能够识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点将 DNA 分子切断。

这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。

不同的限制性内切酶识别的序列不同,这为基因工程的操作提供了丰富的选择。

限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀,能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。

比如,EcoRI 能识别GAATTC 序列,并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。

2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后,需要将它们与其他DNA 片段连接起来,这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。

DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起,形成一个完整的 DNA 分子。

想象一下,DNA 连接酶就像是一个“胶水”,把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起,使它们成为一个连续的整体。

3、 DNA 聚合酶在基因工程中,DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。

例如,PCR(聚合酶链式反应)技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。

通过 PCR 技术,我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段,为后续的实验和应用提供足够的材料。

4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA(cDNA)。

这在获取真核生物的基因时非常有用,因为真核生物的基因中含有内含子,而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子,更便于在原核生物中表达。

二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。

它具有自主复制能力,可以在细菌细胞内独立存在和复制。

分子克隆常用工具酶

分子克隆常用工具酶
Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分
离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶,最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol/L),在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有 低活性,Ca2+使其完全失活,一价阳离子高至0.1 moI /L对活性无影响,而最适浓度NaCl为40 mmol/L,KCl 为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl),与大肠杆菌DNA聚合酶相比,其 最大特性是耐高温和无核酸酶活性
第二章 分子克隆常用工具酶
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DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链,极性相反,反向平行 • 以中心为轴,向右盘旋
植物基因工程
植物基因工程
Replication
2)平末端DNA片段的连接
a. 直接用T4 DNA连接酶连接:效率不高,较少采用。 b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段:先用末端核苷酸转
移酶,给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA 连接酶进行连接 c. 用衔接物连接平末端DNA分子:目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点,经酶切后产生 特异的粘性末端,从而与具有互补末端的DNA连接
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA,产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸,同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温(72℃)下的单链DNA为模板,从5'→3'方向合成新生的互补 链

第二章基因工程中常用的工具酶

第二章基因工程中常用的工具酶

第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

§2-1 核酸内切限制酶定义:核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。

双链结构的核酸内切酶。

到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。

种以上不同的核酸内切限制酶。

核酸内切限制酶的发现及其生物功能(图)一 、限制修饰系统的种类(图)限制修饰系统的种类(图)二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义:广义指上述三个系统中的限制酶;广义指上述三个系统中的限制酶;狭义指II 型限制酶。

型限制酶。

2. 命名:限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。

限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。

例如:Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ,“d”表示菌系为d型血清型;“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

表示分离到的第三个限制酶。

Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列,但它们的切割作用却是随机的,在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子,因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。

2基因工程-工具酶

2基因工程-工具酶
酶 HindIII Sma I 最适温度oC 37 25 酶 Apy I BstE II 最适温度oC 30 60 酶 Ban I BsmBI 最适温度oC 50 55



4.DNA的分子结构: DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影 响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性 的DNA量高出很多倍。 5.缓冲液:影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓 冲液。化学组成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和离子强度;Tris-HCl维持pH; 二硫苏糖醇(DTT)保持酶稳定性;牛血清白蛋白BSA等有助于酶的稳定。

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链
DNA序列的一种内切核酸酶。[单位定义]在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合 物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
命名:限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。
第1个字母取自产生该酶的细菌属名,大写 第2,3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字 母,小写 第4个字母代表株,小写 最后用大写罗马数字,代表同一菌株中不同限制 酶的编号

8 个碱基识别位点:NotⅠ GC↓GGCCGC
以上序列中部分字母代表的碱基如下:

R=A或G;Y=C或T;M=A或C;K=G或T;S=C或G;W=A或T H=A或C或T;B=C或G或T;V=A或C或G;D=A或G或T;N=A或C或G或T
特性
限制和修饰活性 内切酶的蛋白结构 限制作用所需要的 辅助因子 宿主特异性识别 切割位点 酶催转换 DNA易位作用 甲基化作用的位点 识别未甲基化的序 列进行切割 序列特异的切割 基因工程中的用途

基因工程中常用的酶

基因工程中常用的酶

分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性,限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长, 切割位点不规则;Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短,切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割, 可以将DNA片段分离出来,再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中,使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中,制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶, 通过聚合核苷酸片段,合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性,能够在特定的模板指导下, 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同,反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中,反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA,以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA,再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段,进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶,是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性,能够识别并切割DNA中的 特异序列,切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
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CCGG N’ N’N’N’N’ CCGG
Fok I 5’-GGATG(N)9-3’
3’-CCTAC(N)13-5’ 外侧,产生5’-端突起 2)富含GC
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四.限制酶的特点
3)对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
Fok I 5’-GGATG(N)9-3’ 5’-GGATG(N)9
3’-CCTAC(N)13-5’ 3’-CCTAC(N)13
b)能识别简并顺序的,如:AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁,转化,核酸纯化,检测等
3. III型:修饰酶与I型酶相同,hsdM与hsdS基因产物结合成一
亚单位,限制酶是独立存在的。 上述三个系统中,只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸
识别特异性,因而被广泛用于基因工程中。
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三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义:广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制 酶。
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四.限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 1)识别4-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN;AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC;PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC; SfiI GGCC N N N N N GGCC
2. 命名:限制酶由三部分构成,即细菌种属名、菌系编号、 分离顺序。
例如:HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae,“d”表示菌系为d型血清型;“Ⅲ”表示分离
到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
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6、限制性内切酶的星号活性
引起星号活性的可能因素
甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子的变化 溶液中PH值的变化
在基因工程操作中,应避免星号反应的出 现
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二、限制酶的使用方法
用限制酶消化DNA(酶切)是基因工程 最基本的实验技术
最常用的消化条件: 反应体积:20ul 10xBuffer:2ul DNA浓度:0.5—1.0ul
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6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下,限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化,结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位 点,得到不同的酶切片断,这就是限制 酶的星号活性(star activity)
EcoR 1 GAATTC----AATT
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限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列.并使每条链的一个磷酸二
酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现,1968年分离到I型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现 H.O.Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌(H.
5’-GOH
PAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTTAAP
HOG-5’
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四.限制酶的特点
3) 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC GGG-3’
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG CCC-5’
4)非互补的粘性末端
a)切点在识别顺序之外的,如:FokI
4)切点大多数在识别顺序之内,也有例外
5)限制酶切后产生两个末端,末端结构是5’-P和3’-OH
2. 末端种类
1)3’-端突起,个数为2或4个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’
5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’
3’-G
ACGTC-5’
2)5’-端突起,个数为2或4个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’
specificity for DNA restriction modification and specificity) 位于染色体上,三个基因构成一个复合体,限制酶需要ATP、Mg2+、 SAM(5—腺苷甲硫氨酸)。
2. II型:限制与修饰基因产物独立起作用,在E. coli中这两种基
因位于质粒上。
五. 异源同序酶(isoschizomer, 同裂酶)
1. 定义:能识别相同序列但来源不同的两 种或多种限制 酶 2. 特点:1)识别相同顺序
2)切割位点的异同
KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG
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influenzae)中发现并分离到HindII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans(1971年)用HindII绘制SV40的限制酶谱。
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二、限制修饰系统的种类
1. I型:由三个基因构成,hsdR;hsdM;hsdS(host
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第二节 天然DNA的制备
天然DNA的来源
染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒 DNA、线粒体和叶绿体DNA
天然DNA的提取
准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA
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第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化
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