含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法的研究

文章编号:1001-7658(2004)10-0293-04

=论著>

含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法的研究

王炜红 陈微娜 葛 洪 侯延文 林 玲 宋长江

(黑龙江省疾病预防控制中心,哈尔滨 150036)

提要 为研究含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法,依照2002年版5消毒技术规范6规定的试验程序进行了实验室观察。结果,含有效氯800mg/L 的次氯酸钠、10mg/L 的优氯净和50mg/L 二氧化氯对Vero 细胞生存率无影响;用0.01mol/L PBS 配制的5g/L 硫代硫酸钠中和剂对Vero 细胞生存率无影响。用含5g/L 硫代硫酸钠中和剂对含有效氯400mg/L 的次氯酸钠设计的6组中和剂鉴定试验,结果符合设计要求。用该方法检测证明,以含有效氯400mg/L 次氯酸钠消毒剂,作用30min,对脊髓灰质炎病毒平均灭活对数值\4.0。试验发现,0.03mol/L 的PBS 、卵磷脂以及吐温80对Vero 细胞生存率均有影响。关键词 脊髓灰质炎病毒;中和剂;有效氯;灭活试验中图分类号:R187.2 文献标识码:A

STUDY ON TEST METHOD FOR INAC TIVATION OF POLIOVIRUS BY C HLOR INE -C ONTAIN -ING DISINFECTANTS

WANG Wei -hong,C HE N Wei -na,GE Hong ,HOU Yan -wen,LIN Ling ,SO NG Chang -jiang

(Heilongjian g Provincial Center for Disease Prevention and Con trol,Harbin 150036,China)

Abstract In order to study the test method for inactivation of poliovirus by chlorine-containing disinfectants,laboratory obser -vation was carried out according to the test procedures specified in 5Disinfection T echnical Guidelines 6,2002ed.The results showed that sodiu m hypochlochlorite containing available chlorine 800mg/L,10mg/L You-L -Ji ng ,50mg/L chlorine diox ide and 5g/L sodi um thiosulfate neutralizer reconsti tuted with 0.01mol/L PBS had no influence on survival rate of Vero cells.The results of neu tralizer identification test,in which 6groups were designed using 5g/L sodium thiosulfate as the neutralizer for 400mg/L sodiu m hypochlori te disinfectant,fulfilled the requirement of ing this method,it was proved that sodium hypochlori te containi ng available chlorine 400mg/L with a 30min con tact time could inactivate polivirus wi th an average inacti va -tion logarithm \4.0.It was found by test that 0.03mg/L PBS,lecithin and tween 80had influence on survival rate of Vero cells.Key words p oliovirus ;neutralizer ;available chlorine;inactivation test

1作者简介2 王炜红(1958-),女,黑龙江哈尔滨市人,大学,副主任

医师,从事病毒防治、消毒学及医院感染控制工作。

2002年版5消毒技术规范6采用脊髓灰质炎病毒1型疫苗株作为病毒灭活试验代表,并规定了相应的试验方法。脊髓灰质炎病毒属无包膜小RNA 病毒,对外界理化因子抗力比较强,培养制备方法比较简单,在很多细胞内均可生长,用其作为评价消毒理化因子灭活指标国内外都有应用11,22。但在体外灭活试验中,很多试剂对细胞生长有不同程度的毒性,如消毒试验中的消毒剂、中和剂及稀释液等,给试验带来一定的困难。为了科学评价消毒剂对该病毒的灭活效果,依据5消毒技术规范6规定的试验程序,以含氯消毒剂为对象,在实验室研究了脊髓灰质

炎病毒的灭活试验方法。现将结果报告如下。1 方法

1.1病毒滴定方法

用Vero 细胞培养制备的脊髓灰质炎病毒1型疫苗株(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)悬液,再用细胞维持液进行10倍系列稀释,每个稀释度接种(96孔培养板)4孔,置于37e 二氧化碳培养箱内培养。逐日观察结果,连续观察5d,记录细胞病变情况,计算半数细胞感染剂量(TCID 50)。1.2中和剂鉴定试验132

1.2.1预备试验 分别测定消毒剂、中和剂、中和产物对细胞生长的影响。¹取次氯酸钠、优氯净和二氧化氯系列稀释液,分别接种于已经形成单层细胞

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的培养板上,吸附2h,更换维持液,置于37e 二氧化碳培养箱内培养。º分别取5g/L 硫代硫酸钠的PBS 和含5g/L 硫代硫酸钠+10g/L 吐温80+1g/L 卵磷脂的PBS 的系列稀释液,分别接种单层细胞培养。»将800mg/L 二氧化氯消毒剂与º中的两种中和剂以1:9比例配制成中和产物,接种单层细胞培养。

1.2.2正式鉴定试验 依照5消毒技术规范62.1.1.10条款规定的程序,设计6组试验(表3),对400mg/L 有效氯的次氯酸钠消毒剂作中和剂鉴定试验。1.3病毒灭活试验

取保存的脊髓灰质炎病毒悬液100L l 与3%小牛血清白蛋白100L l 混合,置于19~21e 水浴恒温5min,加入800L l 消毒剂混合均匀。作用30min,取出0.1ml 加到0.9ml 中和剂小试管内,中和作用10min 。取中和后样液接种细胞,连同阳性对照和阴性对照一并培养,观察并记录细胞病变情况,计算半数细胞感染剂量(TCID 50)。2结果

2.1中和剂鉴定预备试验结果

2.1.1消毒剂对细胞生长的影响结果 含有效氯800mg/L 次氯酸钠、10mg/L 优氯净和50mg/L 二氧化氯对细胞生长均无影响;高于上述浓度均有影响(表1)。

表1三种含氯消毒剂对细胞生长率的影响

Table 1Influence of 3chlorine -containing disinfectants on

growth rate o f cells

消毒剂名称Disi nfec tant 有效氯含量(mg/L)/细胞生存率(%)Available chlorine content (mg/L)/survival rate of cells (%)

次氯酸钠Sodium hypo- c hlorite 2000/0.00

1000/0.00800/100.00600/100.00优氯净Yon-Lu- Jing 40/0.00

30/0.00

20/62.50

10/100.00

二氧化氯Chl orine dioxi de

200/0.00

150/0.00

100/62.50

50/100.00

注:阴性对照细胞生长正常。试验重复3次。

Note:The negative control cells gre w normally.The tes t was triplicated.

2.1.2中和剂对细胞生长的影响结果 在5g/L 硫代硫酸钠中加入吐温80和卵磷脂对细胞生长有明显影响;0.03mol/L 磷酸盐缓冲液亦影响细胞生长,但0.01mol/L 则无影响。用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液配制的5g/L 硫代硫酸钠中和剂对细胞生长无影

响。

2.1.3中和产物对细胞生长的影响结果 用800mg/L 二氧化氯和400mg/L 次氯酸钠与5g/L 硫代硫酸钠的PBS(0.01mol/L)以1:9比例配制的中和产物对细胞生长均无影响(表2)。

表2中和产物对细胞生长影响试验结果

Table 2Results of test for influence o f neutralizing product on

cell growth

消毒剂Disinfectant 中和剂组成Netralizer

稀释比例Dilution 细胞平均生存率Average s urvi val rate of cells(%)

二氧化氯5g/L 硫代硫酸钠原液100.00Chlorine 5g/L sodium thiosulfate

1B 2

100.00

di oxide

二氧化氯5g/L 硫代硫酸钠+10原液0.00Chlorine g/L 吐温80+1g/L 1B 225.00 di oxide

卵磷脂

1B 4

100.00

5g/L sodium thiosulfate +10g/L t ween 80+ 1g/L lecithi n

次氯酸钠5g/L 硫代硫酸钠+原液100.00Sodium 0.01mol/L PBS 1B 2

100.00

hypoch-5g/L sodium thiosulfate

lori te

注:试验重复3次。

Note:The tes t was triplicated.

2.2中和剂鉴定试验结果

按预备试验确定的条件,采用6组试验方案和判断标准,用0.01mol/L PB S 配制的含5g/L 硫代硫酸钠溶液可有效中和含有效氯400mg/L 的次氯酸钠,中和剂及中和产物均对培养细胞无影响(表3)。

表3次氯酸钠中和剂试验结果

Table 3Results of sodium hypochlorite neutralizer test

组 别Group

各次试验病毒滴度(TCID 50)对数值(log)

Logari thm (log)of vi rus titer (TCID 50)in each test

平均值Average

1

231 1.50 1.17 1.83 1.5020.500.670.830.673 5.50 5.50 5.50 5.504 4.50 5.23 4.50 4.745

5.50

5.67

5.83

5.67 注:第6组细胞生长正常。

Note:The cells of 6th group grew normally.

2.3病毒灭活试验结果

采用上述试验选出的中和剂,按悬液试验程序结果证明,以含有效氯400mg/L 的次氯酸钠溶液对

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