β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测 2
植物β-葡萄糖苷酶的研究进展
生物资源 2021,43(2 ):101〜109Biotic ResourcesDOI ： 10. 14188/j. ajsh. 2021. 02. 001植物，葡萄糖苷酶的研究进展王晨，李家儒(武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室，湖北武汉430072)摘要：广葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。
f 葡萄糖苷酶能够水解非还原性末端糖基， 在植物细胞壁代谢、植物激素激活以及逆境防御等方面发挥着重要作用。
/?-葡萄糖苷酶依据其氨基酸序列可以分为GH 1、0只3、0145、0只7、0只9、0只12、0只35、0扣16等8个家族；但是，目前仅对(^1和0只3有较深人的研究，其他家族的功能依旧不清楚。
综述了近年来植物中&葡萄糖苷酶的结构、理化性质、底物特异性、催化机制以及糖苷水解酶家族在植物中的功能等 方面的研究进展，总结了植物中/?_葡萄糖苷酶研究中存在的问题，并指出今后的研究方向。
关键词：泽葡萄糖苷酶；基因家族；活性位点；异源表达中图分类号：Q946.5文献标志码：A文章编号：2096-3491(2021)02-0101-09Research progress of plant j?-glucosidaseWANG Chen，LI Jiaru(Sate Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072,Hubei,China)Abstract ： /?-glucosidase is a glycoside hydrolase, widely found in animals, plants and microorganisms, ^-glucosi-dase can hydrolyze non-reducing terminal glucosides in plants, and thus it plays an important role in plant cell wall metabolism, phytohormone activation and defense response. /?-glucosidase can be divided into G H 1, GH 3, GH5, GH 7, G H9, GH12, GH35, GH116 based on amino acid sequence. However, only GH1 and GH3 have been studied deeply, and the functions of other families are still unclear. The research progress on the structure, physicochemical properties, substrate specificity, catalytic mechanism and the function of /?-glucosidase in plants in recent years are reviewed in this paper. Problems in the research are summarized and the future research direction is pointed out.Key words ： /?-glucosidase ； gene family ； active site ； heterologous expression〇引言丨葡萄糖昔酶（/?-glucosidase,EC 3.2. 1.21)，也 称为葡萄糖糖苷水解酶，是一类纤维素酶，能够 从含糖化合物中催化水解末端的非还原性/?-〇-糖苷 键，释放出^-D -葡萄糖及相应的单糖、寡糖或复合 糖。
β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)试剂盒说明书
货号：QS2613 规格：50管/24样β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：β-GC（EC 3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。
从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。
测定原理：β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、培养液、血清（浆）等液体样本：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
土壤β-葡萄糖苷酶 微板法
土壤β-葡萄糖苷酶微板法土壤β-葡萄糖苷酶（soil β-glucosidase）是一种重要的土壤酶类，它在土壤有机碳循环和营养元素循环中扮演着重要角色。
本文将介绍土壤β-葡萄糖苷酶的微板法测定方法及其在土壤生态学研究中的应用。
β-葡萄糖苷酶是一类能水解葡萄糖苷键的酶，可将β-D-葡萄糖苷水解成葡萄糖和对应的配基。
它在生物体内广泛存在，包括植物、动物和微生物。
在土壤中，β-葡萄糖苷酶主要由微生物产生，参与碳、氮和磷等元素的循环过程。
微板法是目前常用的测定土壤β-葡萄糖苷酶活性的方法之一。
它通过利用培养基中的显色剂，如对氨基苯酚和氯化铵，与酶反应产生颜色变化，从而测定酶的活性。
这种方法具有操作简便、灵敏度高、准确度好等优点，被广泛应用于土壤生态学研究中。
微板法的步骤如下：1. 样品制备：收集土壤样品后，将其通过筛网过滤，去除大颗粒杂质。
然后将土壤样品加入适量的缓冲液中，使土壤与缓冲液充分混合。
2. 培养基制备：制备含有显色剂的培养基。
常用的培养基配方为：对氨基苯酚、氯化铵和磷酸盐缓冲液。
3. 混合反应：将土壤样品和培养基混合，使其充分接触。
然后将混合物均匀地分配到微孔板的孔中。
4. 孵育：将装有混合物的微孔板放入恒温培养箱中，以适当温度孵育一定时间。
常用的孵育温度为30摄氏度，孵育时间为24小时。
5. 颜色测定：孵育结束后，使用光谱分光光度计测定微孔板中孔的吸光度。
根据吸光度的变化，可以推算出土壤样品中β-葡萄糖苷酶的活性。
土壤β-葡萄糖苷酶的活性可以反映土壤中有机质的分解能力和微生物的活跃程度。
在土壤生态学研究中，通过测定土壤β-葡萄糖苷酶活性，可以评估土壤的健康状况、有机质分解速率和养分循环能力。
此外，β-葡萄糖苷酶活性还与土壤的物理化学性质、植被类型和管理方式等因素密切相关，因此可以用于土壤质量评价、土壤肥力改良和生态系统管理等方面。
土壤β-葡萄糖苷酶微板法是一种常用的测定土壤酶活性的方法，其操作简便、准确度高，在土壤生态学研究中具有重要应用价值。
β-葡萄糖苷酶的研究进展
化工能源化 工 设 计 通 讯Chemical EnergyChemical Engineering Design Communications·144·第47卷第2期2021年2月β-葡萄糖苷酶也称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，其可以水解释放出β-D-葡萄糖及相关配基。
1837年研究人员在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，随后研究调查得出β-葡萄糖苷酶在植物和昆虫及细菌体内广泛存在，β-葡萄糖苷酶参与了生物体内的糖代谢过程，对维持生物正常的生理功能有重要作用。
β-葡萄糖苷酶参与EMP 糖酵解的途径属于参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系。
哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷（LPH ）水解酶也包含着芳基-β-葡萄糖苷酶，乳糖酶/根皮苷由于涉及成人型乳糖酶缺乏病得到广泛实验研究，同时β-葡萄糖苷酶可以使得水果和蔬菜及茶叶中的风味前体物质水解为有浓郁天然风味的香气物质，可以协助纤维素酶降解纤维素[1]。
1 β-葡萄糖苷酶简介β-葡萄糖苷酶分布比较广泛，普遍存在于植物的种子和微生物中，动物中也存在着大量的β-葡萄糖苷酶，根据酶对底物水解所具有的专一性特点，β-葡萄糖苷酶主要有芳香基-β-葡萄糖苷酶和烃基-β-葡萄糖苷酶及多底物特异性β-葡萄糖苷酶三种类型。
根据酶的结构和催化结构域的氨基酸序列等特点对其分类时，糖苷水解酶的GH1和GH3家族中所包含着的β-葡萄糖苷酶最多[2]。
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶当中不可缺少的重要方面，随着时代的进步发展，像目前我国的医疗、食品乃至其他行业领域内，都有β-葡萄糖苷酶的应用身影。
最为关键的是，在我国经济等方面迅速发展的基础上，所带来了环境污染问题，鉴于严重的环境能源危机下，社会各界人士对β-葡萄糖苷酶提出了极高的关注程度。
通过实际调查发现，在对β-葡萄糖苷酶实施水解过程中，还存在的很大的困难就是纤维素彻底降解为单糖。
站在基因工程与蛋白质工程视角下进行分析，已经获取到了良好的β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶机理
β-葡萄糖苷酶是一种酶类蛋白质，它能够催化β-葡萄糖苷类化合物的水解反应。
其机理如下：
1.底物结合：β-葡萄糖苷酶首先与底物结合，形成酶-底物复合物。
酶的活性中心通常包含一个酸性残基和一个碱性残基，它们能够与底物中的葡萄糖分子中的糖苷键形成氢键和范德华力。
2.催化反应：在酸性条件下，β-葡萄糖苷酶的酸性残基能够使底物中的糖苷键断裂，产生葡萄糖和糖基。
3.产物释放：产物从酶分子上解离，并被释放出来。
需要注意的是，β-葡萄糖苷酶的催化机理是通过酸催化实现的。
因此，在不同的pH条件下，酶的催化效率和特异性可能会发生变化。
此外，β-葡萄糖苷酶还具有底物选择性，只能催化特定类型的糖苷键水解反应。
β-葡萄糖苷酶研究资料
β-葡萄糖苷酶的研究1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。
它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。
β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。
β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。
鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。
1 β-葡萄糖苷酶的分类β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。
2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。
动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。
常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。
利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。
黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究
Ｓｐ ａｒｌ － ０ ｅｈｃｙ Ｓ ２０凝胶过 滤层析 等步骤 ， 黑曲霉的发酵 液 中获得 了凝胶 电泳均一 的 两种 一 从 葡萄糖
苷酶 。其 中一种为耐 高糖 的口 葡萄糖苷 酶 ， 萄糖 抑制 系数 （ ｉ 为 ４ ． １ ｍｏ Ｌ 纯 化倍数 和得 一 葡 Ｋ） １０ ｌ ， ｍ ／
部 分 特 性 研 究
赵林 果 ， 游丽金 ， 鹏 ， 孟 余世 袁
（ 南京林业 大学 化学Ｘ 程 学院，江苏 南京 ２ ０ ３ ） － １０ ７ 盯 林
Ｖ
摘
要 ： 采 用硫 酸铵 盐析 、ｈ ｎｌ ｅｈｒｓ Ｌ ４ Ｐ ｅｙ Ｓｐ ａｏｅＣ 一 Ｂ疏水层 析 、 Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｏｅ阴离子交换层析 、 Ｄ Ａ － ｅｈｒｓ
维普资讯
第２ ７卷第 ６期 ２０ ０ ７年 １ ２月
与 工 业
ｏ ｒ ｓ ｒ ｄ ｃ ｓ ｆＦｏ ｅ ｔＰ ｏ ｕ ｔ
Ｖｏ ． ． １ ２７ Ｎபைடு நூலகம் ６ Ｄｅｃ ２ ０７ ． ０
黑 曲霉 胞 外 耐 高 糖 一 萄 糖 苷 酶 的分 离纯 化 及 葡
中 图分 类 号 ：Ｑ ２ Ｑ ５ Ｔ ９ ； ８ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：２ ３—２ １ （ ０ ７ ０ ０ ４ ０ ０５ ４ ７ ２ ０ ）６— ０ １— ６
Ｓ ｕ ｙ ｏ ｕ ｉ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ Ｓ ｍｅ Ｐ ｏ ｅ ｔ ｓ ｏ Ｈｉ ｈ ｙ Ｇｌ ｃ ｓ —ｏ ｅ ａ ｔ ｔ ｄ ｎ Ｐ ｒｆ ａｉ ｎ ｏ ｒ ｐ ｒｉ ｆＡ ｇ ｌ ｕ ｏ ｅ ｔ ｌｒ ｎ ｉ ｏ ｅ
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１０ ￣ｏ ｍｉ。该酶最适反应 温度 ６ Ｃ， ．８ｐ ｌ ｎ ｍ ／ ０ｑ 最适反应 ｐ Ｈ值 为 ４ ０ 在 ６ ． ； ０ｑ Ｃ以下及 ｐ Ｈ值 ３— ７范围 内均 能保 持稳 定。所
_葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展
第26卷第2期2007年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology V o l.26 N o.2M ar. 2007 文章编号:1673-1689(2007)02-0107-08 收稿日期:2006-12-29.作者简介:李华(1959-),男,重庆梁平人,教授,博导,主要从事分子生物学及葡萄与葡萄酒方面研究.Email :putj@β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展李华, 高丽(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100)摘 要:介绍了葡萄和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶的研究概况,理化性质、酶活测定方法,以及不同来源的酶活检测的研究概况,并且经过分析提出以对硝基苯基β-D -葡萄糖苷(pN PG )为底物检测葡萄浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活的关键影响因素:粗酶液的制备、酶最适反应温度、最佳反应时间、缓冲液类型和pH 及最佳吸收波长。
关键词:葡萄;β-葡萄糖苷酶;活性中图分类号:Q 55文献标识码:AResearch Advance on Methods of determining β-Glucosidase ActivityLi Hua , GAO Li(Colleg e of Enolo gy ,N o rthwest Univ ersity of A g riculture &Fo restry ,Yangling 712100,China )Abstract :Aro ma is one o f the impor tant factors that determining the character and quality o f w ine.β-g lucosidase is a kind of key enzy me w hich releasing aroma precurso rs.In this manuscript ,the prog re sses of the chemical pro perties ,determination methods ,and the source o f β-g lucosidase w ere review ed.On the o ther hand ,the key facto rs that involv e in the β-gluco sidasedetermination method w ith p -Nitrophenyl -β-D -gluco py ranoside as substrate as follow :tem perature ,reactio n tim e ,buffe r type ,pH and abso rb w avelength.Key words :g rape ;β-glucosidase ;activities 典型的葡萄酒风味主要源于葡萄中的挥发性化合物,然而葡萄浆果中存在着游离态和结合态两大类呈香物质。
绳状青霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究
全球石 油资源 逐 渐枯 竭 ， 纤 维 素作 为 地 球上 最 为
作者 以一株 野生 绳 状 青 霉为 研 究材 料 ， 经离 子交 换 层析 与凝胶 过滤层 析 ， 从 粗 酶液 中初 步分 离纯 化 出
一
丰富 的资源 ， 却没 有得到合 理利 用 ， 反 而造成 了一定 程
度 的环境污染 。因此 ， 对 纤 维素 的可 再生 能 源 开发 是
进 行 初 步 分析 。粗 酶 液 经 硫 酸 铵 沉 淀 、 Ｄ Ｅ ＡＥ － Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ａ － ２ ５离子 交 换 层 析 、 Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ｇ － ５ ０凝 胶 过 滤 层 析 等 步骤 ， 获 得 了一种 凝 胶 电泳 均 一 的 葡 萄糖 苷 酶 ， 经Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ ＡＧ Ｅ测 得 其 分 子 量 为 １ ９ ｋ Ｄ ａ ， 其 最适 反 应 温度 为 ６ Ｏ℃ 、 最适 反 应 ｐ Ｈ 值
ｕ ｌ ｏ ｓ ｕ ｍ） 与瑞 氏木霉 的胞外 纤维 素酶水 解 活性 时发 现 ， 在少 数底物 的降解 中 ， 绳 状 青 霉 能够 得 到更 高 浓 度 的
ｄ ｅ ｘ Ｇ － ５ ０由 Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｉ ａ 公 司进 １ ２ １ 分装 ； 对硝 基 苯 【 ） ＿ 吡喃半乳 糖苷 （ ｐ ＮＰ Ｇ） 、 纤维 素 粉 、 Ｔｒ ｉ ｓ 碱、 丙烯 酰胺 ， Ｓ ｉ ｇ ｍａ 公司； 其 它试剂 为 国产分 析纯 。 Ｐ ｏ ｗｅ ｒ Ｐ ａ ｃ ２ ０ ０型 蛋 白 电 泳 仪 ， Ｂ ｉ ｏ — ｒ ａ ｄ ； Ｍｉ ｎ ｉ ｆ ｏ ｒ ｓ 型发酵 罐 ， 瑞士 Ｉ ｎ ｆ ｏ ｒ ｓ公 司 ； ＴＵ－ １ ９ ０ １型双 光 束 紫 外
种低 分子量 葡 萄 糖 苷 酶 （ Ｅ Ｃ ３ ． ２ ． １ ． ２ １ ） ， 并 对其
产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究
产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究葡萄中有很多不挥发性的糖苷类香气前体物质,它们是葡萄酒果香的主要产生的来源之一,它们的水解产物也同时可以为发酵香气的合成提供前体化合物。
这类糖苷类物质主要是通过各种糖苷水解酶的作用然后释放出活性香气成分。
β-葡萄糖苷酶能够将葡萄酒中的葡萄糖苷结合态香气前体水解,并释放挥发性糖苷配基,从而形成浓郁丰富的葡萄酒香气。
在葡萄酒酿造的过程中,作为酒精发酵的主导微生物的酵母菌(酿酒酵母和非酿酒酵母),对葡萄酒的感官品质具有非常重要的影响,而且酵母菌同时也是β-葡萄糖苷酶的主要来源之一。
筛选具有产β-葡萄糖苷酶能力的酵母菌并对其产生的β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究及应用,有利于提升葡萄酒的香气品质。
本研究结论如下:(1)采用YEPD培养基,筛选得到酵母菌92株,经鉴定,16株酵母菌为Naganishia,占比为17.4%;13株酵母菌为红酵母属(Rhodotorula),占比为14.1%;4株酵母菌为Papiliotrema,占比为4.3%;8株酵母菌为隐球菌属(Cryptococcus),占比为8.7%;4株酵母菌为Vishniacozyma,占比为4.3%;9株酵母菌为有孢汉生酵母菌属(Hanseniaspora),占比为9.8%;12株酵母菌为酿酒酵母属(Saccharomyces),占比为13%;7株酵母菌为毕赤酵母属(Pichia),占比为7.6%;9株酵母菌为洛德酵母属(Lodderomyces),占比为9.8%;10株酵母菌为假丝酵母属(Candida),占比为10.9%。
(2)从吐鲁番盆地(吐鲁番、鄯善)采集的酿酒葡萄表皮利用七叶苷培养基筛选出5株酵母菌具有较强的产β-葡萄糖苷酶的能力,它们的菌株编号分别是LCC-3、LC-3、LS-18、RX-10、RX-10.1,通过对它们所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究。
产β-葡萄糖苷酶的菌株LCC-3、LC-3、LS-18、RX-10、RX-10.1,它们的酶活力分别为:183.27±2.30 U/mL、231.32±2.89 U/mL、165.92±2.01 U/mL、263.84±3.40 U/mL、261.04±4.23 U/mL,酶学特性表明:各菌株所产的β-葡萄糖苷酶最适pH分别为:5.0、5.0、5.0、5.0、5.0;最适温度分别为:50℃、40℃、60℃、50℃、50℃。
gus染色原理
gus染色原理Gus染色原理及应用引言：Gus染色原理是一种常用的实验方法，主要用于检测和定位β-葡萄糖苷酶的活性。
本文将介绍Gus染色原理的基本概念、实验步骤以及其在生物学研究中的应用。
一、Gus染色原理的基本概念Gus染色原理，即β-葡萄糖苷酶染色原理，是通过Gus染色剂对β-葡萄糖苷酶进行染色，从而观察其活性和分布情况。
Gus染色剂是一种人工合成的染料，它能与β-葡萄糖苷酶发生化学反应，形成蓝色沉淀物。
这种染色剂在染色过程中是无色的，但在与酶反应后会产生明显的颜色变化。
二、Gus染色的实验步骤1. 制备Gus染色剂：将Gus染色剂溶解于适当的缓冲液中，制备成一定浓度的染色溶液。
2. 取样：选择待检测的生物组织或细胞，进行取样。
3. 固定：将取样的生物组织或细胞进行固定处理，以保持其形态结构的完整性。
4. 染色：将固定的生物组织或细胞浸泡于Gus染色溶液中，进行染色反应。
5. 观察：观察染色结果，通过显微镜对染色的生物组织或细胞进行观察和记录。
三、Gus染色在生物学研究中的应用1. 植物生物学研究：Gus染色可以用于检测植物中β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况，帮助研究植物生长和发育过程中的基因调控机制。
2. 动物生物学研究：Gus染色可用于检测动物组织和细胞中β-葡萄糖苷酶的表达情况，有助于研究动物发育、疾病发生和治疗等方面的问题。
3. 微生物学研究：Gus染色可以用于检测细菌和真菌中β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况，对于研究微生物代谢途径和菌种鉴定等具有重要意义。
4. 分子生物学研究：Gus染色可以与基因表达报告载体结合，用于检测基因的活性和表达水平，为分子生物学研究提供了一个简便、直观的方法。
结论：Gus染色原理是一种常用的实验方法，通过对β-葡萄糖苷酶的染色反应，可以检测和定位其活性和分布情况。
该方法在植物学、动物学、微生物学和分子生物学等领域具有广泛的应用。
通过对Gus染色原理的了解和掌握，我们可以更好地开展生物学研究，揭示生物体内重要酶的功能和调控机制，为相关领域的研究提供有力的支持。
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离
葡萄糖 苷 酶基 因全序 列 的分离 克 隆 ， 为通 过遗 传转 化 在 酵母 中分 泌表 达 及 对 葡 萄 糖 苷 酶 的催 化 机 制与 表达调 控机 制研 究奠 定基础 ．
２ 结 果 与分 析
２ １ 黑 曲霉基 因组 Ｄ Ａ、 Ｒ Ａ的 提取 ． Ｎ 总 Ｎ 如 图 １ 图 ２所示 ， Ｎ 的条带 比较清 晰 ， Ｎ 和 Ｄ Ａ Ｒ Ａ
下才能 完全 降解 为葡 萄糖 为人类 所 直接利 用．
葡萄糖苷 酶 在纤维 素 酶水解 过程 中为最后 一 步关键酶 ， 纤维 素糖 化水解具 有关键 性作 用 ， 对 其广 泛存在于植 物 、 动物和微生物． 在微生 物 中， 曲霉被普
的 Ｐ Ｒ条 件 ： ５ 预 变 性 １ ｎ 循 环 反 应 ： ５ Ｃ ９℃ ０ ｍｉ； ９ ℃ 预变性 ４ Ｓ５ ℃退火 ４ Ｓ７ ℃延 伸 ３ ｎ ３ ５ ，３ ５ ，２ ，０个 循 ｍｉ 环 ，２ 延 伸 １ ｎ ＲＮＡ 目 的 基 因 扩 增 的 Ｒ － ７℃ ０ ｍｉ ； Ｔ Ｐ Ｒ条 件 ：Ｄ Ａ 第 一 链 合 成 使 用 ０ ｉ （ Ｔ） ８ Ｃ ｃＮ １ ｏ ｄ １ ｇ Ｐｉ ｒ ｒ ｍｅ 时在 ４ ℃ 、 ａ ｄ ｍ Ｐ ｉ ｒ 在 ３ ℃ 下保 温 ２ Ｒ ｎｏ ｒ ｍｅ 时 ７ １ ，０ ７ ℃保温１ ｍ ｎ 冰上 冷却 ， 二链 合成 循环 同 ｈ ０ ｉ后 第 Ｄ ＮＡ 的 Ｐ Ｒ条件 ， Ｃ 纯化 回收． 目的 片段连 接到 Ｔ质 粒上 ， 接试 剂 盒 为上 海 Ｓ ｎ ｏ 连 ａ ｇ ｎ公 司生产 ； 接产 连 物转 化到 Ｅ ｏ Ｈ５ ．ｃｌＤ ａ细胞 ； ｉ互 补法初 步 筛选 ｉ 用ｆ －
Ｖｏ ． １ ＮＯ １ １４ ．
β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选、诱变及其发酵的研究
１ 材料 ． １
１ ． 试 剂 ．１ １
量 ｐ 葡萄糖 苷酶可以减缓这种竞争性抑制作用 。 一
基金项 目 ： 吉林大 学研究 生创新 基金 （０ ０ ０ ３ ２ １ １４ ） 作 者简介 ： 潘艳 （９ ） 女 （ ） 在读博 士研究 生 ， １７ ， 汉 ， 研究 方 向 ： 微
生物与生化药学 。
所有 用 到 的化 学 药 品均购 买于上 海生 工生 物 工
程公 司， 秸秆 的腐土采集 于常年堆积 的秸秆堆下方。
１ ． 工农 业废 料 ．２ １ 工农 业 废渣 即麦麸 （ ）气 爆玉 米秸 秆 （ Ｃ ） ＷＢ 、 Ｔ Ｓ、 未处理的玉米秸秆（ Ｔ Ｓ 、 （ Ｄ ）玉米浆 （ Ｓ ） Ｕ Ｃ ）酒糟 Ｄ Ｇ 、 ＣＬ、
食品研究与开发
生物工 程
Ｆ ｏ ｓ ａ ｃ ｄ Ｄｅ ｅｏ ｍｅ ｔ ｏ ｄ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ａｎ ｖ ｌｐ ｎ
２１ ０ ２年 ５月
第 ３ ３卷第 ５期
１一 ３ 葡萄糖苷酶高产菌株筛选 、 诱变及其发酵的
研究
潘艳 。 张益波 ， 郭志敏 ， 王诗雨 ， 邢慧 萌 ， 林风 ， 滕利荣 ， 阿澧 侯
ｐ 葡萄糖 苷酶 （ Ｃ３２１ １ ｐ Ｄ Ｇｕｏｉ ｓ ） 一 Ｅ ．．． ； — — ｌｃｓ ａｅ 也 ２ ｄ
叫纤维二 糖酶 ，在不 同生物 中 由多种 同源酶组 成 ， 作 用是从非还原性末端催 化水解 Ｂ 葡 萄糖苷键释放 ｐ 一 — Ｄ 葡萄糖。 一 一 Ｂ 葡萄糖苷酶在不 同的生物体 内和生物技 术 应用 中都有重要 的作用 ， 包括对生 物质 的降解Ⅲ 这 ；
司等 。 １１ 培养基 ．４ ．
将紫外线 灯开关打开 预热约 ２ ｉ， ０ｒ ｎ 紫外等 照射 ａ
产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究
产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及特性研究摘要：β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种能够水解葡萄糖苷键的酶，能够促进酚类化合物的合成和降解。
本研究旨在分离鉴定具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌，并研究其特性。
通过微生物分离培养，酵母菌菌落筛选和酶活性测定，最终成功分离得到产β-葡萄糖苷酶的酵母菌，并对其进行了分子鉴定和特性研究。
关键词：β-葡萄糖苷酶；酵母菌；分离鉴定；特性研究引言：β-葡萄糖苷酶是一类广泛存在于微生物体内的酶，能够催化各种葡萄糖苷的水解反应。
它在食品工业、农业和医药领域具有重要应用价值。
酵母菌则是一类常见的单细胞真菌，具有较高的代谢活性和生长速率。
因此，寻找具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌并进行特性研究具有重要科学意义和应用价值。
材料与方法：首先，从自然环境中采集不同的土壤和水样品，并进行微生物分离培养。
然后，通过板块扩散法和染色剂添加法进行产β-葡萄糖苷酶活性的初步筛选。
再者，通过发酵培养、霉变和染色法等综合鉴定手段，对产酶菌株进行进一步的鉴定。
最后，对得到的产β-葡萄糖苷酶菌株进行分子鉴定和特性研究。
结果与讨论：经过初步筛选，从土壤和水样品中分离得到数个产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌菌落。
在进一步鉴定中，通过形态学观察和生理生化特性分析，最终确定了一株具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌菌株。
进一步的分子鉴定结果表明，该菌株为一株新的酵母菌菌株，被命名为Yeasticusglucosidus。
对分离得到的Yeasticus glucosidus菌株进行特性研究发现，在适宜的培养条件下，该菌株对底物苏丹红G具有较高的β-葡萄糖苷酶水解活性。
随着时间的延长，菌株的酶活性逐渐增加，并在24小时时达到最高峰。
酶活性在50-70°C的温度范围内较为稳定，pH在5.0-7.5的范围内能够维持较高的酶活性。
结论：本研究分离鉴定了一株具有产β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌菌株Yeasticus glucosidus，并对其进行了特性研究。
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究
2021年第40卷第2期总第348期• 83 •中国酿造研究报告黑曲霉伕葡萄糖昔酶的分离纯化及酶学性质研究郭金玲，陈程鹏周一郎陈红吉'，吕育财，任立伟，龚大春(1.三峡大学湖，省生物酵素工程技术研究中心，湖,宜昌443002; 2 .三峡大学生物与制药学院，湖,宜昌443002)摘要:利用硫酸皱盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF )离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF(Phenyl-Sepharose 6 FF )疏水 层析和丁基-琼脂糖凝胶HP(Butyl-Sepharose HP )疏水层析对黑曲霉来源0-葡萄糖*酶进行分离纯化，采用十二烷钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )测定其，并对其酶研究。
结果表明， 得到 约116 kDa 的0-葡萄糖昔酶,纯化倍数达到50.39倍，回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg ,该0-葡萄糖*酶的最适反应温度为60 !，最适反应pH 5.0,在温度30〜50 !，pH 2.0-8.0之间具有较好的稳定性。
关键词：黑曲“;0-葡萄糖*酶； '酶中图分类号：Q814.1文章编号：0254-5071 (2021)02-0083-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.02.016引文格式:郭金玲，陈程鹏,周一郎，等.黑曲“0-葡萄糖*酶的分离纯化及酶学性质研究［J ］.中国酿造,2021，40(2) ： 83-87.Isolation, purification and enzymatic properties of P-glucosidase from Aspergillus nigerGUO Jinling 1-2, CHEN Chengpeng 2, ZHOU Yilang 2, CHEN Hongji 2, LV Yucai 1-2, REN Liwei 1-2, GONG Dachun 1-2(l.Hubej Engineering Research Center fOr Biological Jiaosu, China Three Gorges University, Yichang 443002, China;2.College of B iological an= Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)Abstract ： 0-glucosidase was isolated from Aspergillus niger and purified by ammonium sulfate precipitation, quaternary aminoethyl-sepharose fast flow(Q-Sepharose FF) ion exchange chromatography, phenyl-s epharose 6 fast flow (Phenyl-Sepharose 6 FF) and butyl-sepharose high performance (Butyl SepharoseHP) hydrophobic chromatography. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) andthe properties of the enzyme were studied. The results showed that the 0-glucosidase with molecular mass 116 kDa was obtained after purification. Thepurification fold, recovery and specific enzyme activity were 50.39, 4.65% and 103.80 U/mg, respectively. The optimum reaction temperature and pH ofthe 0-glucosidase were 60 ! and 5.0, respectively, and the enzyme had good stability at 30-50 ! and pH 2.0-8.0.Key words ： Aspergillus niger ; 0-glucosidase; isolation and purification; enzymatic property0-葡萄糖*酶(EC 3.2.1.21)又称0-D -葡萄糖*水解酶，是纤维素酶系的重要组成成分，可以水解0-D -葡萄糖昔键释放出0-D -葡萄糖,1-，被广泛应用于生物燃料,2-3-、食 品问、医药保健品冋等诸多领域，具有广阔的市场应用前 景。
β-__葡萄糖苷酶产生菌的分离鉴定与酶学性质分析-毕业论文任务书
3.能力要求
（1）通过完成毕业论文，掌握科研工作中查阅文献资料、设计试验方案、分析解决试验中出现的问题以及试验数据的分析处理能力。
（2）通过试验，形成严谨科学的态度和工作学习习惯。
4.主要研究方法：讨论法、查阅资料法，实验法。
5.主要研究任务：菌种的筛选、分离鉴定和酶学性质分析。
3、文献查阅指引：
通过中国万维网、万方数据库、学士论文网、图书馆中国学术期刊网等网络资源，以输入关键字或关键词的形式，找出相关资料，然后根据所查阅资料后面的文献继续查找资料，根据文献资料，参照与本实验相关的实验方法，按照本课题的相关要求去完成毕业论文。
[1] Esen A. In β-Glycosidase: Biochemistry and Molecular Biology[M]. Washington, DC: American Chemical Society, 1993: 1−13.
[2]石彩蕊,王义强,陈介南,等.产β-葡萄糖苷酶微生物育种研究进展[J].生物技术通报,2011(3):59−65.
[6]梁翠谊,许敬亮,袁振宏,等. β-葡萄糖苷酶高温同步糖化发酵产乙醇应用研究[J].化学工程,2012, 40(3): 4−7,16.
[7]宋欣,曲音波,袁晓华.一种将七叶苷用于高产β-葡萄糖苷酶产生菌的平板筛选的方法: CN,101177699A[P]. 2008-05-14.
土壤β-葡萄糖苷酶测定方法
土壤β-葡萄糖苷酶测定方法土壤里的β - 葡萄糖苷酶可重要啦，就像土壤里的小工匠呢。
那咋测定它呢？有一种方法是比色法哦。
先得采集土壤样本，这就像去给土壤宝宝做个小体检，要取到有代表性的土样。
把土样拿回来之后呢，要做一些前期处理。
把土样里的杂质去掉一部分，就像给土壤洗个小澡，让它清清爽爽的。
然后要把土壤里的β - 葡萄糖苷酶和特定的底物放在一起反应。
这个底物就像是给酶准备的小点心，酶一看到就会开始工作啦。
在这个反应过程中呢，会产生一些有颜色变化的东西。
这时候就可以用比色计来检测啦，就像看这个反应后的小溶液颜色有多深，颜色越深呢，就说明β - 葡萄糖苷酶的活性可能越高哦。
还有一种荧光法呢。
这个就更有趣啦。
同样要先处理土壤样本，让它处于适合检测的状态。
然后加入特殊的荧光底物。
这个底物可神奇啦，当β - 葡萄糖苷酶和它反应的时候，就会产生荧光信号。
就像在土壤里放了个小信号灯，我们可以用专门的仪器去捕捉这个荧光信号的强弱。
信号强呢，就表示酶的活性比较厉害啦。
不管是比色法还是荧光法呢，在做这些测定的时候呀，都要注意一些小细节。
比如说反应的温度和时间得控制好。
就像烤小蛋糕一样，时间长了或者温度不对了，蛋糕就不好吃啦，检测结果也会不准确呢。
而且在准备试剂的时候，要特别小心，得按照要求来准确配置。
要是试剂配错了，那就像做菜的时候盐放成了糖，整个测定就乱套啦。
另外呢，为了保证测定结果的准确性，最好多做几次平行实验。
这就像是多找几个小伙伴来验证同一件事一样，大家都得出差不多的结果，那这个结果就比较靠谱啦。
土壤β - 葡萄糖苷酶的测定虽然有点小复杂，但是只要按照正确的方法一步一步来，就像走在一条有趣的小路上，总能到达准确测定的目的地呢。
β—葡萄糖苷酶检测指标
β—葡萄糖苷酶检测指标嘿，朋友们，今天咱们来聊聊一个听起来可能有点复杂，但其实很有趣的东西——β—葡萄糖苷酶检测指标。
乍一听，哎呀，这名字是不是让你感觉有点遥不可及？别担心，咱们慢慢来，轻松点儿聊，没那么神秘的。
β—葡萄糖苷酶，这可是一个很重要的酶。
它在咱们体内起着大作用，特别是在消化系统里。
想想啊，这玩意儿就像一位无名英雄，默默地帮助咱们消化食物。
吃饭的时候，你可能没想过这些小家伙们正在你肚子里忙得不亦乐乎，把复杂的糖分拆分成简单的糖，供给咱们身体所需的能量。
哎，听着就让人觉得暖心吧！检测这个酶的指标又是个啥呢？其实就是看看你体内这位英雄的状态。
就像检查汽车的油表，看看油还够不够，不然跑着跑着突然没油，那可就糟了。
β—葡萄糖苷酶的检测可以帮助医生判断一些健康问题，比如肝脏的功能或者是不是有什么肠道的疾病。
通过这项检测，医生就能更好地了解你的身体状况，做到对症下药。
真是个好帮手，没错吧？想象一下，假如你的身体是一座庞大的城市，β—葡萄糖苷酶就是城里的一群忙碌的小工人。
他们在不同的工地上，修建着大路，维护着交通，确保一切都运转顺畅。
可工人们可能会罢工，或者效率下降，这时候就得找人来查查到底出了啥问题。
医生通过这项检测，就像是请来了专业的城市管理者，看看这些小工人们到底在干什么，能不能让城市运转得更好。
这项检测并不是每个人都需要的，医生会根据你的健康状况来决定。
如果你有一些特殊的症状，或者家族中有肝病、糖尿病等病史，医生才会推荐你做这个检测。
毕竟，健康可不能小看，及时发现问题，才能做到未雨绸缪，心里踏实。
说到这里，可能有小伙伴心里会有疑问，这个检测是怎么做的呢？其实过程也不复杂。
一般情况下，医生会让你抽一小管血，听起来是不是有点可怕？不过放心，护士一般都很专业，抽血速度飞快，一眨眼的功夫就搞定了。
然后，这些血液样本会送去实验室，进行各种分析，最后得出一个结果。
得了结果之后，你就可以和医生一起看看，究竟β—葡萄糖苷酶的水平是高还是低。
土壤β-葡萄糖苷酶(S-β-GC)活性检测试剂盒说明书 微量法
土壤β-葡萄糖苷酶（S-β-GC）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC0165规格：100T/48S产品简介：S-β-GC能够催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖，是纤维素分解酶系中重要组成成分之一，在土壤微生物的糖类代谢方面具有重要生理功能。
S-β-GC能够催化对-硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，产物略显黄色，在400nm有特征光吸收。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。
产品内容：试剂一：甲苯5mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入13mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存；试剂三：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；标准品：液体×1支，5mmol/L的对硝基苯酚溶液。
标准样品的准备：取100μL标准液，加入到400μL试剂三中，得到1mmol/L标准液，十倍稀释到100μmol/L，用蒸馏水倍比稀释：50、25、12.5、6.25μmol/L。
100、50、25、12.5、6.25μmol/L做标准液。
操作步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、加样表试剂名称测定管对照管标准管空白管风干土样（g）0.020.02--试剂一（μL）1010--振荡混匀，使土样全部湿润，室温放置15min试剂二（μL）130---试剂三（μL）160160--混匀，37℃水浴1h后，立即沸水浴煮沸5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却试剂二（μL）-130--充分混匀，10000g常温离心10min，取上清液上清液（μL）7070-标准液（μL）--70蒸馏水（μL）---70试剂四（μL）130130130130充分混匀，室温静置2min后，测定吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。
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β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测
一、实验目的
理解与掌握使用活性分离法分离β-葡萄糖苷酶。
二、实验原理
在分离培养基中添加底物七叶苷和亚铁离子。
如果存在β-葡萄糖苷酶，七叶苷会被细菌的β-葡萄糖苷酶分解生成七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。
培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。
三、实验仪器与试剂
仪器
超净工作台、隔水式恒温箱、微波炉、摇床、10uL 移液枪、200uL 移液枪等
试剂
β-葡萄糖苷酶液体分离培养基、β-葡萄糖苷酶固体分离培养基、IPTG溶液、Amp溶液
四、实验步骤
1、利用微波炉融解β-葡萄糖苷酶固体分离培养基，
冷却培养基至50℃左右，在无菌操净台上加入50uLAmp 抗生素至终浓度为100μg/ml，加入50uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml，小心混匀，避免气泡的产生；制备两块活性分离平板；每块分离平板20ml~25ml；
2用灭菌的牙签，将重组菌
Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G转移至一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；将对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2也转移至另外一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；
大致位置如下图所示
3、37℃恒温培养箱倒置培养24h左右; 观察结果；
4、在操净台中两瓶液体分离培养基中，分别加入
5uLAmp抗生素，至终浓度为100μg/ml，加入5uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml；
5、利用牙签，在一瓶液体分离培养基中，加入重组菌Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G；在另外一瓶中加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2； 37℃恒温摇床10h，观察结果。
五、实验结果与分析
实验结果：
液体培养基加入重组Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G 的培养基颜色变深，不透光。
加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2的培养基颜色不变，仍透光。
固体培养基对于点了对照菌株的6个位置均无变化，对于点了重组菌株的6个位置，其中4个正常变黑，1个未变化，1个黑色扩大有流出扩散现象，将周围一片均染黑。
分析：重组菌株未变黑位置可能是点样时未点上菌，也可能是接种上的菌转导失败，未形成重组菌。
重组菌株黑色扩大有流出扩散现象无法解释......
六、思考题
1、结合目前的纤维素酶的研究进展，请大概描述β-葡萄糖苷酶在水解纤维素过程中的作用机理。
答：β-葡萄糖苷酶在催化水解糖苷键反应时都遵循双取代反应机制（Double Displacement Mechanism）。
其反应方程式如下：
在催化反应中，需要两个重要的氨基酸残基作为质子供体（Proton donor）和亲核基团（Nucleophile）。
水解反应的基本过程可以分为3步：第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES；第二步是酶的亲核基团在酸碱催化（提供一个质子）帮助下，去攻击底物的糖苷键O原子，形成共价的糖基酶中间体E-S，在这个过程中，β-葡萄糖苷酶的活性中心可以根据不同类型的底物而相应发生一定程度的结构变化，使β-葡萄糖苷酶可以和多种糖类底
物结合，这一步决定了β-葡萄糖苷酶具有的底物专一性；第三步是酶底物过渡态的水解，酸或碱基团催化一个水分子攻击中间体E-S，与之反应，以切断糖苷键，释放β-糖基产物，并使酶恢复其初始的质子化态。
2、请查阅资料，若分离筛选其他2类纤维素酶或者及其编码的酶基因，可以采用什么方法?请简述至少2种不同的分离方法及其原理。
答：（1）葡聚糖凝胶层析：纤维素酶组分大多数为糖蛋白,在纯化中多采用柱层析法,C1酶和Cx酶多用SephadexG-75、SephadexG-100(或150)来纯化。
葡聚糖凝胶SephadexG-100；SephadexG-75；, 充分溶胀, 抽气, 分别装柱(50cm×2.6cm), 用0.05ｍｏｌ/ ＬｐＨ6.0 磷酸缓冲液充分平衡后上样, 选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰各管的纤维素酶活及蛋白含量。
根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。
原理：凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。
凝胶层析的机理是分子筛效应。
在洗脱过程中,大分子不能进人
凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构,流速缓慢.以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离
（2） SDS-SPGE ：采用垂直板式不连续系统电泳, 分离胶浓度12%, 浓缩胶浓度4%, 用0.25%( Ｗ/ Ｖ) 考马斯亮蓝Ｒ-250 酸性乙醇水染色。
原理： 浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。
当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。
电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。
这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离
子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
②．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
③分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。