β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测 2

β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测

一、实验目的

理解与掌握使用活性分离法分离β-葡萄糖苷酶。二、实验原理

在分离培养基中添加底物七叶苷和亚铁离子。如果存在β-葡萄糖苷酶，七叶苷会被细菌的β-葡萄糖苷酶分解生成七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。

培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。

三、实验仪器与试剂

仪器

超净工作台、隔水式恒温箱、微波炉、摇床、10uL 移液枪、200uL 移液枪等

试剂

β-葡萄糖苷酶液体分离培养基、β-葡萄糖苷酶固体分离培养基、IPTG溶液、Amp溶液

四、实验步骤

1、利用微波炉融解β-葡萄糖苷酶固体分离培养基，

冷却培养基至50℃左右，在无菌操净台上加入50uLAmp 抗生素至终浓度为100μg/ml，加入50uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml，小心混匀，避免气泡的产生；制备两块活性分离平板；每块分离平板20ml~25ml；

2用灭菌的牙签，将重组菌

Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G转移至一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；将对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2也转移至另外一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；

大致位置如下图所示

3、37℃恒温培养箱倒置培养24h左右; 观察结果；

4、在操净台中两瓶液体分离培养基中，分别加入

5uLAmp抗生素，至终浓度为100μg/ml，加入5uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml；

5、利用牙签，在一瓶液体分离培养基中，加入重组菌Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G；在另外一瓶中加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2； 37℃恒温摇床10h，观察结果。

五、实验结果与分析

实验结果：

液体培养基加入重组Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G 的培养基颜色变深，不透光。加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2的培养基颜色不变，仍透光。

固体培养基对于点了对照菌株的6个位置均无变化，对于点了重组菌株的6个位置，其中4个正常变黑，1个未变化，1个黑色扩大有流出扩散现象，将周围一片均染黑。

分析：重组菌株未变黑位置可能是点样时未点上菌，也可能是接种上的菌转导失败，未形成重组菌。

重组菌株黑色扩大有流出扩散现象无法解释......

六、思考题

1、结合目前的纤维素酶的研究进展，请大概描述β-葡萄糖苷酶在水解纤维素过程中的作用机理。

答：β-葡萄糖苷酶在催化水解糖苷键反应时都遵循双取代反应机制（Double Displacement Mechanism）。其反应方程式如下：

在催化反应中，需要两个重要的氨基酸残基作为质子供体（Proton donor）和亲核基团（Nucleophile）。水解反应的基本过程可以分为3步：第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES；第二步是酶的亲核基团在酸碱催化（提供一个质子）帮助下，去攻击底物的糖苷键O原子，形成共价的糖基酶中间体E-S，在这个过程中，β-葡萄糖苷酶的活性中心可以根据不同类型的底物而相应发生一定程度的结构变化，使β-葡萄糖苷酶可以和多种糖类底

物结合，这一步决定了β-葡萄糖苷酶具有的底物专一性；第三步是酶底物过渡态的水解，酸或碱基团催化一个水分子攻击中间体E-S，与之反应，以切断糖苷键，释放β-糖基产物，并使酶恢复其初始的质子化态。

2、请查阅资料，若分离筛选其他2类纤维素酶或者及其编码的酶基因，可以采用什么方法?请简述至少2种不同的分离方法及其原理。

答：（1）葡聚糖凝胶层析：纤维素酶组分大多数为糖蛋白,在纯化中多采用柱层析法,C1酶和Cx酶多用SephadexG-75、SephadexG-100(或150)来纯化。葡聚糖凝胶SephadexG-100；SephadexG-75；, 充分溶胀, 抽气, 分别装柱(50cm×2.6cm), 用0.05ｍｏｌ/ ＬｐＨ6.0 磷酸缓冲液充分平衡后上样, 选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰各管的纤维素酶活及蛋白含量。根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。

原理：凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。凝胶层析的机理是分子筛效应。在洗脱过程中,大分子不能进人

凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构,流速缓慢.以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离

（2） SDS-SPGE ：采用垂直板式不连续系统电泳, 分离胶浓度12%, 浓缩胶浓度4%, 用0.25%( Ｗ/ Ｖ) 考马斯亮蓝Ｒ-250 酸性乙醇水染色。

原理： 浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离

子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。②．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。

③分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带