第三章 常用生物化学检验技术PPT课件
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发射光谱是由物质分子或原子吸收了外来 的能量后发生分子或原子间的能级跃迁而 产生的光谱。
分类
❖ 吸收光谱分析法：
❖ 1、可见分光光度法、 测定有色物质
❖ 2、紫外分光光度法、 测定无色物质
❖ 3、红外分光光度法、 测定物质结构
❖ 发射光谱分析法
❖ 1、火焰光度法、
测定离子
❖ 2、荧光法
❖ 散射光谱分析法
200— ------ 400—---------760 —---1000nm
紫外谱光
可见光谱
红外光谱
❖ 光谱分析技术： ❖ 利用物质的吸收光谱、发射光谱、散射
光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术。
吸收光谱（absorption spectrum）即物 质对不同波长光的吸收程度不同而产生的 光谱。
光源种类：
可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。
紫外光光度计常用氢灯作为光源。
（二）单色器
定义：
将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。
种类：
滤光片
棱镜
光栅
（三）比色杯
又称为吸收池或比色皿
材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成
（四）检测器
检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。
标准曲线使用注意事项
①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ②吸光度在0.05-1.0范围内。 ③所作标准曲线仅供短期使用。 ④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进
行，避免误差产生。
应用中注意的问题
① Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓 度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0 之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符
b:液层厚度
I:透射光强度
T:透光度
A:吸光度
k:吸光系数
b
三、分光光度计的基本结构
最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计
结构： 五大部份
光源 单色器 比色杯 检测器 显示器
（一）光源
光源定义：
指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源 应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好 的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变 化。
的浓度成正比。
（一）对比法（标准对照法）
实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同 样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。
A标准=ε标准C标准L标准 A样品=ε样品C样品L样品 A：吸光度；ε ：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度
因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品= ε标准
因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准
② 选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干 扰
③ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶 质以外所有的成分。
空白管：
测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光 吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其 它的成分完全相同。
测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色 皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测 值即为待测物造成的光吸收。
❖ 比浊法
❖ 彩虹，又称天虹，简称虹，是气象中的一种 光学现象，当太阳光照射到半空中的水滴， 光线被折射及反射，在天空上形成拱形的七 彩的光谱，彩虹的七彩颜色究竟是哪七种有 不同的说法，东亚、中国对於七色光来说最 普遍的说法是（从外至内）：红、橙、黄、 绿、青、蓝、紫或红、橙、黄、绿、蓝、靛、 紫，而西方常用的排色则为后者去掉靛色而 成为六色。
一、分光光度技术的基本原理
❖ （一）、光的吸收现象和吸收曲线 互补色光：
两种颜色的光，按适当的强度、比例混合 后可成为白色的光，这两种色光成为互补色 光。
（二）、光吸收定律
☺ 朗伯-比尔定律：
T
I
10kbc
I0
Alg Tlg源自文库 lgI0lg1kbc I0 I T
I0
I
I0：入射光强度
C:溶液浓度
❖ ⑤应用范围窄：主要用于碱金属和部分碱土 金属的测定。
仪器装置（1）
FP640火焰光度计
火焰光度法分析示意图
1.光源系统2.光学系统3.检测系统
（一）、基本原理
❖ 火焰光度法的定量原理与发射光谱相同。 即：试样受激发后发射的谱线强度 I 与试样 浓度C成正比，
❖ 火焰光度法的定义
❖ 火焰光度法是以火焰为激发光源， 用光电检测系统测量被测元素所 发射的辐射强度来进行定量分析 的方法。
❖ 它是一种简化的发射光谱分析法。
火焰光度分析法
❖ 火焰光度法是以火焰为激发光源，用光 电检测系统测量被测元素所发射的辐射 强度来进行定量分析的方法。
❖ 它是一种简化的发射光谱分析法。
第三章 常用生物化学检验技术
第一节 光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
按波长区域分
1、紫外光谱： 波长范围：200—400nm 2、可见光谱： 波长范围：400—760nm 3、红外光谱： 波长范围：760—1000nm
特点
①快速：试样溶液于数分钟内可完成测定。 ②准确：火焰光源稳定性高，干扰少，误差 为2％~5％，可用于微量分析和常量分析。 ③灵敏：分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏 度可达0．1～10×10－6 g。
❖ ④设备简单：被测试样易被火焰激发，产生 的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线 分离和测量的设备简单。
（五）显示器
是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 装置。
❖ 721 可见分光光度计
❖ 722系列 可见分光光度计
❖ SP-756P紫外可见分光光度计
❖ TENSOR系列红外光谱仪
四、分光光度技术的定量测定方法
测定原理
1.物质对光线有选择性吸收作用。 2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质
故上二式可写成： A标准/A样品= ε标准C标准/ ε样品C样品 C样品=A样品/A标准 × C标准
（2）标准曲线法
配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管 同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。
以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座 标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线 上读得测定物的浓度。
分类
❖ 吸收光谱分析法：
❖ 1、可见分光光度法、 测定有色物质
❖ 2、紫外分光光度法、 测定无色物质
❖ 3、红外分光光度法、 测定物质结构
❖ 发射光谱分析法
❖ 1、火焰光度法、
测定离子
❖ 2、荧光法
❖ 散射光谱分析法
200— ------ 400—---------760 —---1000nm
紫外谱光
可见光谱
红外光谱
❖ 光谱分析技术： ❖ 利用物质的吸收光谱、发射光谱、散射
光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术。
吸收光谱（absorption spectrum）即物 质对不同波长光的吸收程度不同而产生的 光谱。
光源种类：
可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。
紫外光光度计常用氢灯作为光源。
（二）单色器
定义：
将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。
种类：
滤光片
棱镜
光栅
（三）比色杯
又称为吸收池或比色皿
材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成
（四）检测器
检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。
标准曲线使用注意事项
①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ②吸光度在0.05-1.0范围内。 ③所作标准曲线仅供短期使用。 ④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进
行，避免误差产生。
应用中注意的问题
① Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓 度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0 之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符
b:液层厚度
I:透射光强度
T:透光度
A:吸光度
k:吸光系数
b
三、分光光度计的基本结构
最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计
结构： 五大部份
光源 单色器 比色杯 检测器 显示器
（一）光源
光源定义：
指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源 应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好 的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变 化。
的浓度成正比。
（一）对比法（标准对照法）
实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同 样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。
A标准=ε标准C标准L标准 A样品=ε样品C样品L样品 A：吸光度；ε ：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度
因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品= ε标准
因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准
② 选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干 扰
③ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶 质以外所有的成分。
空白管：
测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光 吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其 它的成分完全相同。
测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色 皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测 值即为待测物造成的光吸收。
❖ 比浊法
❖ 彩虹，又称天虹，简称虹，是气象中的一种 光学现象，当太阳光照射到半空中的水滴， 光线被折射及反射，在天空上形成拱形的七 彩的光谱，彩虹的七彩颜色究竟是哪七种有 不同的说法，东亚、中国对於七色光来说最 普遍的说法是（从外至内）：红、橙、黄、 绿、青、蓝、紫或红、橙、黄、绿、蓝、靛、 紫，而西方常用的排色则为后者去掉靛色而 成为六色。
一、分光光度技术的基本原理
❖ （一）、光的吸收现象和吸收曲线 互补色光：
两种颜色的光，按适当的强度、比例混合 后可成为白色的光，这两种色光成为互补色 光。
（二）、光吸收定律
☺ 朗伯-比尔定律：
T
I
10kbc
I0
Alg Tlg源自文库 lgI0lg1kbc I0 I T
I0
I
I0：入射光强度
C:溶液浓度
❖ ⑤应用范围窄：主要用于碱金属和部分碱土 金属的测定。
仪器装置（1）
FP640火焰光度计
火焰光度法分析示意图
1.光源系统2.光学系统3.检测系统
（一）、基本原理
❖ 火焰光度法的定量原理与发射光谱相同。 即：试样受激发后发射的谱线强度 I 与试样 浓度C成正比，
❖ 火焰光度法的定义
❖ 火焰光度法是以火焰为激发光源， 用光电检测系统测量被测元素所 发射的辐射强度来进行定量分析 的方法。
❖ 它是一种简化的发射光谱分析法。
火焰光度分析法
❖ 火焰光度法是以火焰为激发光源，用光 电检测系统测量被测元素所发射的辐射 强度来进行定量分析的方法。
❖ 它是一种简化的发射光谱分析法。
第三章 常用生物化学检验技术
第一节 光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
按波长区域分
1、紫外光谱： 波长范围：200—400nm 2、可见光谱： 波长范围：400—760nm 3、红外光谱： 波长范围：760—1000nm
特点
①快速：试样溶液于数分钟内可完成测定。 ②准确：火焰光源稳定性高，干扰少，误差 为2％~5％，可用于微量分析和常量分析。 ③灵敏：分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏 度可达0．1～10×10－6 g。
❖ ④设备简单：被测试样易被火焰激发，产生 的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线 分离和测量的设备简单。
（五）显示器
是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 装置。
❖ 721 可见分光光度计
❖ 722系列 可见分光光度计
❖ SP-756P紫外可见分光光度计
❖ TENSOR系列红外光谱仪
四、分光光度技术的定量测定方法
测定原理
1.物质对光线有选择性吸收作用。 2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质
故上二式可写成： A标准/A样品= ε标准C标准/ ε样品C样品 C样品=A样品/A标准 × C标准
（2）标准曲线法
配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管 同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。
以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座 标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线 上读得测定物的浓度。