最新植物体内转化酶活性的测定
植物生理学实验报告植物NR活力测定——体内法(活体法)
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：植物NR活力测定——体内法（活体法）一、实验目的和要求掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。
二、实验内容和原理实验原理：硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，与作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根：NRNO3-+NADH++H+ NO2-+NAD++H2O测定原理：根产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加。
磺胺先与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。
反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、主要仪器设备1.材料：在20℃蒸馏水培养一周小麦苗，实验前一天分两组，一组加KNO3，一组加0.5 mM CaCl2，在白天置光照下处理。
2.试剂：磺胺试剂、萘基乙烯二胺溶液，酶促反应液（PBs+KNO3）3.器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、操作方法与实验步骤1. 事先制作好NO 2-标准曲线。
2. 在20℃蒸馏水培养一周小麦苗，实验前一天分两组，一组加KNO 3，一组加0.5 mM CaCl 2，在白天置光照下处理。
3. 取各组苗地上部约0.5 g 左右,切成合适长度(1cm 左右)，放入50mL 注射器中。
4. 加酶促反应液10ml,抽气直到材料完全下沉（一只手戴上手套，用戴手套的食指封住注射器头，另一只手反复推拉抽气减压，将叶片中的空气赶尽，直到材料完全下沉）。
5. 置恒温箱30℃ 20min ，取出后将反应液注射入烧杯中。
6. 取4ml 反应过的液体，加磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml,室温放置5min 后测540 nm OD 。
五、实验数据记录和处理1. NO 2-标准曲线2.六、实验结果与分析NO 2-标准曲线为： y = 0.0062x + 0.0283 (R 2 =0.9962)对照组NO 2-（nmol ）= （0.115-0.0283）/0.0062 = 13.98处理组NO 2-（nmol ）= （0.280-0.0283）/0.0062 = 40.60NR 活力（NO 2-生成nmol/（鲜重g.h ））= NO 2-（nmol ）×3×（10/4） /实际重量g对照组NR 活力 = 13.98 * 3 * 2.5 /0.52 = 201.63（nmol/g.h ） 取苗上部重量 OD540值 对照组 0.52g 0.115 处理组 0.51g 0.280处理组NR活力 = 40.60 * 3 * 2.5 /0.51 = 597.06（nmol/g.h）七、讨论、心得1.比较KNO3诱导和加NH4Cl的NR活力大小，诱导时如用NaNO3替代KNO3结果会如何，为什么？如不进行光照，结果会怎么样，为什么？A.如用NaNO3替代KNO3，那么光合呼吸作用减弱，酶的活力降低，从而影响硝酸根转化为亚硝酸根，实验中可能两组紫红色的颜色差别很小，使测得的还原酶活力偏低。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
测定酶活方法
Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding方法1测定土壤及植物水状况（1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。
在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。
（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。
（3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。
在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。
Notice 1RWC计算：RWC=（W f－W d）／（W t－W d）×100%2WC计算：WC=（W f－W d）／W f×100%W f：叶片鲜重；W d：叶片干重；W t：叶片吸水饱和时的重量。
2酶粗提液的制备为了测定CA T，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。
上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。
为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。
上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。
试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。
3酶活性的测定所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。
蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定
实验四蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定参考一、实验意义和目的 (2)二、实验原理 (2)三、材料、设备与试剂 (3)四、实验步骤 (3)1.蔗糖合成酶活性测定实验 (3)2.转化酶活性测定 (4)五、实验结果与分析 (4)1.蔗糖合成酶活性测定.................................................................... 错误!未定义书签。
2.转化酶活性测定............................................................................ 错误!未定义书签。
六、误差分析........................................................................................... 错误!未定义书签。
一、实验意义和目的蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质，其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响。
蔗糖合成酶(SuSy)是植物进行蔗糖代谢的关键酶之一,与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关，在植物的生长发育和代谢活动中具有重要作用。
转化酶也是催化蔗糖降解的重要酶类，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，还是控制淀粉合成的关键酶，测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。
通过本实验要掌握三种酶的作用、酶活力测定的原理和方法、学习酶活力的计算方法，了解糖类水解。
二、实验原理1.蔗糖合成酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+UDP 果糖+UDPG。
2.转化酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+H2O—►葡萄糖+果糖。
根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶分为两种：一种称为酸性转化酶，主要分布在液泡和细胞壁中，另一类转化酶称为碱性或中性转化酶，主要分布在细胞质中。
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定【原理】谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。
称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
GS和GOGAT酶活性测定
实验报告（修改中勿动）9月8日张青谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μm ol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml 的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）←以加入1.6ml反应混合液A的为对照。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
植物体内硝酸还原酶活性的测定
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
植物酶活指标
植物酶活指标植物酶活性指的是植物体内酶的催化活性程度，也称为酶活力。
植物体内酶活性与植物生长发育、代谢、环境适应能力等密切相关。
因此，研究植物酶活性指标具有重要的科学意义和应用价值。
一、植物酶活指标的类型1、氧化还原酶：包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等。
2、酯酶：包括脂肪酶（LIP）和酯酶（EST）等。
3、氨基酸、蛋白质和多糖酶：包括谷氨酸脱氢酶（GDH）、丝氨酸脱酸酶（SDH）、多酚氧化酶（PPO）、多酚酶（POD）、木质素过氧化物酶（LPO）和纤维素酶等。
二、植物酶活指标的意义1、判断环境胁迫：有研究表明，氧气自由基及其产生的活性氧分子是植物生长发育、代谢过程中的一个重要因素。
而氧化还原酶在植物体内具有极高的活性，能够迅速清除氧气自由基及其产生的活性氧分子。
因此，通过测定植物体内氧化还原酶活性，可以判断环境胁迫程度及其对植物的影响。
2、评估生长发育状态：氨基酸、蛋白质和多糖酶等酶在植物体内能够催化孢子、芽、花、果实等生长发育过程中的代谢反应。
因此，可以通过测定这些酶活性的变化，来评估植物的生长发育状态。
3、诊断植物病害：植物病害的发生与否及其严重程度，常常会影响植物体内某些酶的活性，如过氧化物酶和谷氨酸脱氢酶等。
因此，通过测定植物体内的酶活性，可以较为准确地诊断植物病害。
三、植物酶活指标的测定方法1、样品的预处理：将植物材料（如叶片、根、果实等）取出后，立即将其冷冻或干燥，以避免其酶活性受到破坏。
2、酶活测定方法：根据不同酶的特点和催化反应特性，选择相应的酶活测定方法。
如氧化还原酶可以采用光谱方法或电化学法进行测定，酯酶可以采用碳酸酯法、碱式溶液法或带有色团的底物法进行测定，而氨基酸、蛋白质和多糖酶可以采用比色法、光度法或重量法进行测定。
四、植物酶活指标的应用1、农业生产领域：在农业生产中，常常需要对作物的生长发育状态和抗逆能力进行评估，而植物酶活指标的变化能够反映出相应的信息，因此可以用于指导作物的种植和环境调控。
酶活性的测定(青苗教育)
6
技能教育
过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名 触酶(Catalase，CAT)，是一类以铁卟琳为 辅基的结合酶，由4个亚基组成，分子量为 240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧 化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生 的过氧化氢分解成H2O和02，避免了H202在体 内积累，从而可维持体内正常的活性氧水 平。是最早发现的与种子活力有关的氧化 酶类之一.
19
技能教育
测定茶树鲜叶APX活性的最佳条件
PVPP的加入量为鲜叶重的1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
20
技能教育
注意事项：
（1）由于测定反应是通过测定反应底物AsA的降 低来计算APX活性，因此所加的酶量一般不宜过大 ，应使加液量控制在60s内，使产生的A290光值下 降呈良好的线性关系。
反应液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。
在三个比色皿中各加入20µL鲜叶APX粗酶液， 再加入3mL反应液；1号比色皿中不加AsA和 H吸2O光2启值动的反变应化；X。每室10温s连下续每记一录分室钟温氧下化290nm 1µmolAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）。
29
技能教育
.SOD活性测定：
将样液加入到Tris缓冲溶液中，其余步骤同自 氧化速率测定方法。 活力单位定义：将一定条 件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量 定义为一个单位（u）。
30
技能教育
过氧化物酶(ＰＯＤ)活性的测定 —愈创木酚法
一、实验原理
过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反 应，产物为醌类化合物。
实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。 在此酶存在下，H2O2 将愈创木酚氧化生成 茶褐色产物。此产物在470nm 有最大光吸 收，故可通过470nm处的吸光度变化测定过 氧化物酶的活性。
植物体内过氧化物酶活性的测定
植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控 IAA 水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的 H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色 4 －邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（ A ）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（ pH7 ）。
反应液（100ml 0.1mol · L－1磷酸缓冲液（ pH6 ）中加入 0.5ml 愈创木酚、 1ml 30 ﹪ H 2 O 2，充分摇匀）。
四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片 1g ，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在 8000 r / min 离心 15min ，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定吸取反应液 3ml 于试管中，加入酶提取液 0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径 1cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在 470nm 波长处，以时间扫描方式，测定 3min 内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△ A 470 ）。
五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△ A 470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） = ————————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
GS和GOGAT酶活性测定
实验报告（修改中勿动）9月8日张青谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μm ol·mg﹣1protein·h﹣1。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml 的36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）←以加入1.6ml反应混合液A的为对照。
内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。
酶活性的测定
低温酶学
五、pH 对酶反应的影响
最适pH时的酶 最适 时的酶 活力最大
•最适 因酶而异， 最适pH因酶而异 最适 因酶而异， 多数酶在7.0左右 多数酶在 左右 •是酶的特性之一 是酶的特性之一
连续监测法所需仪器
仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、 高速冷冻离心机、微量移液器等
过氧化物酶活力的测定
操作步骤
一、酶液提取
分别精确 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约 精确 5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓 冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。 将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。
酶活性单位(U 酶活性单位 )
按照国际酶学会议 的规定，1个酶活 力单位是指在25℃ 、测量的最适条件 （指最适pH、温 度等）下，1分钟 内能引起1微摩尔 底物转化的酶量。
术语酶活力指的是 溶液或组织提取液 中总的酶单位数。
在酶的纯化过程中 常用到另一个术语 （specific activity） ）
比活
是指每毫克蛋白含有的酶单位数。 是指每毫克蛋白含有的酶单位数。随着 毫克蛋白含有的酶单位数 酶纯化的进行，比活会越来越高， 酶纯化的进行，比活会越来越高，当酶 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 所以比活是酶纯化程度的指标 指标。 所以比活是酶纯化程度的指标。
双分子反应、 双分子反应、一级反应
酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程 、
1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 年 和 提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－ 物浓度关系的数学方程式 ，即米 － 曼氏方程 简称米氏方程(Michaelis equation)。 式，简称米氏方程 。
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
植物sod测定方法
植物sod测定方法一、植物SOD测定的重要性。
1.1 植物的健康指标。
植物SOD（超氧化物歧化酶）就像是植物体内的小卫士。
它的含量和活性对植物健康有着至关重要的意义。
如果把植物比作一个小王国，那SOD就是守护这个王国免受自由基侵害的英勇战士。
自由基就像一群小坏蛋，到处搞破坏，而SOD能把这些自由基转化为无害的物质，让植物茁壮成长。
1.2 研究植物生理的关键。
在植物生理学的研究领域里，SOD测定那可是相当重要的一环。
就好比我们要了解一个人的身体状况，得先看看他身体里的免疫系统强不强一样。
对于植物来说，SOD 的情况就是了解其生理状态的一个关键窗口。
通过测定SOD，我们可以知道植物在不同环境下的适应能力，是被干旱折磨得奄奄一息，还是在肥沃土壤里生机勃勃。
二、常见的植物SOD测定方法。
2.1 邻苯三酚自氧化法。
这种方法有点像一场化学魔术。
邻苯三酚在一定条件下会自氧化，产生超氧阴离子自由基，这就像是魔法里召唤出了小恶魔。
而SOD呢，它能抑制这个自氧化的过程，就像正义的魔法师出手阻止恶魔作恶。
我们通过测量不同反应体系中邻苯三酚自氧化的速率，就能算出SOD的活性。
这就好比看魔法师出手的速度和力度，来判断他的魔法能力有多强。
不过呢，这个方法也有点小脾气，对实验条件要求比较严格，就像娇贵的大小姐，稍有不慎就可能得出不准确的结果。
2.2 氮蓝四唑法。
氮蓝四唑法也是个挺常用的办法。
在这个方法里，SOD就像是个神秘的画家。
在有光的情况下，植物的叶绿体或者其他相关物质会产生超氧阴离子自由基，这个自由基会和氮蓝四唑发生反应，让溶液变色，就像画布被涂上了颜色。
而SOD会阻止这个变色的过程，我们根据溶液颜色变化的程度就能确定SOD的活性。
这就好比看画家阻止画布被乱涂乱画的能力，来判断他的绘画功力。
这个方法相对来说比较稳定，就像老实可靠的老黄牛，虽然可能没有那么多花哨的地方，但能稳稳地给出结果。
2.3 化学发光法。
化学发光法那可有点高大上了。
GUS酶活性测定
GUS酶提取
• 取植物样品（叶、根）20mg于预冷的1.5mL eppendorf管中，加入液氮研磨成粉末，加 入200uL的提取buffer，混匀； • 13000rpm, 4℃离心15min，吸取上清于另一 eppendorf管中4℃备用。可以做几个平行。
MU标准曲线的制作
用反应终止液将MU母液（1mM）稀释成浓度范围在0－10uM的 系列标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。
样品GUS酶活性测定
1. 样品蛋白含量的测定：取出提取的上清液20ul加双蒸水 定到1ml,加入3毫升的G250 室温反应至少5min,但是不要 超过1h,一般是半个小时后,用分光光度计来测定吸光度 (595nm)后从标准曲线上读数； 2. 设定时间内的4-MU浓度测定：取10ul蛋白上清，加入 390ul反应缓冲液里(37℃预热)，立即取100ul加入到900ul 反应终止液(0时的空白对照)，37℃温浴，严格定时， 10min, 30min和60min各取100ul，加入900ul反应终止液。 测定荧光值。根据标准曲线，计算各样品产物浓度； 3. 最后根据公式算出酶活性。
测定原理
GUS酶活性
（pmol 4-MU/hr/ug protein)
反应底物（4-MU）的物质的量 反应时间*蛋白含量 反应底物（4-MU）的浓度*（体积） 反应时间*蛋白浓度*（体积）
注： 1. 4-MU的浓度是由荧光分光光度计测得数值后从标准曲线上读数获得； 2. 反应时间可以设置梯度时间：5min、10min、20min、30min、45min和 60min等, 也可以只取一个时间； 3. 蛋白浓度是通过考马斯亮蓝法测得吸光度后从BSA标准曲线读数获得。
2、GUS assay buffer :
7 实验6 植物NR活性的测定(活体法)
必须经过还原
形成铵态氮
后才能被利用。
福建农林大学-植物生理生化实验室/柯玉琴
《植物生理生化实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ》
硝酸盐的还原
在一般的土壤条件下，NO-3是植物吸收的 主要形式。NO-3进入细胞后被 硝酸还原酶和 学
大 林 农 还原成铵。其中硝酸还原酶 亚硝酸还原酶 建 福 学 大 (NR)是这一反应的限速酶。 林 农 建 福
还原酶，这是高等植物中底物诱导的实例。
福建农林大学-植物生理生化实验室/柯玉琴
《植物生理生化实验A》
测定方法：
离体法:需将材料磨成匀浆,经过低温离心除去残渣， 吸取上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。 由于研磨中NADH 学 受损失,必需外加NADH方 大 林 可测定。 农 建 - 进 福 活体法： 直接用鲜活组织进行测定。环境中的 NO 学 √ 3 大 - 林 入细胞后,被NR还原成NO 2 ,并扩散到细胞外 农 建 福 NO 2 的含量即可 在溶液中积累,测定溶液中
表2 亚硝酸钠标准曲线制作及甘薯叶片NO_2的测定流程 标准曲线
甘薯叶NO 2的测定
6 7
样 （参比） 测1
_
学 大 NaNO2标准液 0 林 农 0.1 0.2 （NO 25μg/ml） 建 蒸馏水(ml) 福 1.0 0.9 0.8
反应液(ml) 1%磺胺试剂(ml) 2
0.02%萘基乙烯胺(ml) 每管含NO-2 的μg数 540nm比色 OD值 2
《植物生理生化实验A》
学 实验六 植物体内硝酸还原酶活力的测定 大 林 农 —活体法 建 福 学 大 林 农 建 ( 福建农林大学 福柯玉琴 )
福建农林大学-植物生理生化实验室/柯玉琴
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物体内转化酶活性的测定
转化酶又称蔗糖酶(β—D—呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。
植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。
它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。
所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。
【原理】
转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。
在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。
不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。
转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。
不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适pH
在7.0以下的为酸性转化酶)。
所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。
【材料、仪器与试剂】
1．材料：植物组织
2．试剂：
（1）提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含5 mmol/L MgCl
2
,
2 mmol/L EDTA-Na
2
,2% 乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSA），2%PVP，5 mmol/LDTT 。
（2）透析缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含2.5 mmol/L MgCl
2
,
1 mmol/L EDTA-Na
2
,1% 乙二醇，1 mmol/L DTT。
（3）酶反应液：80 mmol/L乙酸-K
3PO
4
(pH4.7和pH7.0)缓冲液，内含50 mmol/L
蔗糖。
（4）葡萄糖标准液：1 mg/mL。
（5）3，5-二硝基水杨酸试剂：精确秤取1g 3，5-二硝基水杨酸，溶于20 ml 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 ml。
盖紧瓶塞，勿让CO
2
进入。
若有浑浊可过滤后使用。
材料：小麦叶片、籽粒。
3．设备
冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），1 mL 移液管5支，5 mL带塞试管10支。
【方法与步骤】
1．酶的提取：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml 提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml 装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲
液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml 备用。
2．酶反应：取3支5 mL 具有试管，加入0.95 mL 反应液和50μL 透析后的酶液，30℃水浴中反应10 min 中止反应。
用煮死酶液作对照（煮沸10min ）。
3．还原糖含量的测定：往各反应试管中再加3，5-二硝基水杨酸试剂1 mL ，沸水浴5 min ，冷却至室温，于540nm 比色测定生成的还原糖量。
4．标准曲线制作：取7支5 ml 具塞试管，编号，按下表配置加入各种试剂液，并按上述步骤3进行，测定其吸光度值。
以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量
酶活力（mg 葡萄糖·g -1
FW ·h -1
）=
n t FW C V V S
t
⨯⨯⨯⨯
【结果与计算】
转化酶的活性用还原糖量(mg ／g ·fw ·h)表示，计算公式如下： C 表示从标准曲线查得的葡萄糖量（mg ）； FW 表示组织鲜重（g ）； t 表示反应时间（h ）；
V t 表示提取酶液的总体积（mL ）； V s 表示测定时取用酶液体积（mL ）； n 表示提取液测定中的稀释倍数。
转化酶的测定
转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。
试剂：
1、10%蔗糖溶液
2、葡萄糖标准液（500μg/ml）
3、0.05mol/l的磷酸缓冲液
4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。
方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。
2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。
以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。
3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定
①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：
管号 1 2 3 4 5 6
葡萄糖原液量（ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
加蒸馏水量（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
0 100 200 300 400 500
葡萄糖浓度（μ
g/ml）
在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。
以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。
4、结果计算：
A=(N-N’)*V/(T*W*1000)
A：转化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)
N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V：酶反应液的总体积
T：反应时间W：材料鲜重
公务员职业道德试题和答案
红颜色为正确答案正确率：91%
单选题:1 分多选题:2 分判断题:1 分
根据职务犯罪《立案标准》，涉嫌下列情形的，应予立案
A 个人贪污数额在7千元以上的
B 个人贪污数额在1万元以上的
C 个人贪污数额在3千元以上的
D 个人贪污数额在5千元以上的
单选题
强化监督检查和责任追究,可以切实维护廉洁从政行为规范的
A 权威性和严肃性
B 有效性和可行性
C 权威性和可行性
D 严肃性和有效性
《公务员法》第十二条第八项明确规定，公务员应当履行( )的义务。
A 清正廉洁，公道正派
B 遵守宪法和法律
C 维护国家的安全
D 接受人民监督
某市政府副秘书长王某，因涉嫌受贿罪被检察机关立案侦查。
最终查明，王某利用职权，为张某调动工作并收取张某感谢费3000元；同时，有50万元的钱款王某不能说明其合法来源。
王某的行为( )
A 不构成犯罪
B 只构成受贿罪
C 构成巨额财产来源不明罪和受贿罪
D 只构成巨额财产来源不明罪
单选题
《中国共产党党员领导干部廉洁从政若干准则》所适用的范围不包括
A 人民团体、事业单位中相当于县（处）级以上党员领导干部
B 国有和国有控股企业及其分支机构领导人员中的党员
C 党的机关、人大机关、行政机关、政协机关、审判机关、检察机关中县(处)级以上党员领导干部
D 农村村委会中的党员
单选题
2002年2月21日由人事部颁发的第一个公务员行为的规范性文件是
A 《公务员职业道德培训大纲》
B 《国家公务员行为规范》
C 《中华人民共和国公务员法》
D 《公务员考核规定》
单选题
（）是加强公务员职业道德建设的前提和基础。
A 作风建设。