水通道蛋白0,1在STZ-糖性白内障发病机制中的研究

水通道蛋白0，1在STZ-糖性白内障发

病机制中的研究

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：林雯，谢茂松，徐国兴，何青，郑卫东

【摘要】目的研究水通道蛋白0，1(AQP0、AQP1)在链脲佐菌素(STZ)-糖尿病性白内障发病机制中的作用。方法将40只SD大鼠随机分为对照组与糖尿病性白内障组2组，用STZ腹腔注射诱发糖尿病性白内障，每周观察晶状体的变化。分别于实验开始后2，8周末摘取眼球，采用免疫组织化学染色技术检测AQP0及AQP1在晶状体中的表达，各检测10只大鼠20眼。结果对照组晶状体保持透明，糖尿病性白内障晶状体在2周末出现空泡，8周末完全混浊。AQP0及AQP1在对照组中阳性表达，糖尿病性白内障组2周表达较对照组强，组间差别具有统计学意义(AQP0：t2周末=3.598，P=0.001;AQP1：t2周末=3.103，P=0.004);糖尿病性白内障组8周表达较对照组弱，组间差别具有统计学意义(AQP0：t8周末=6.994，P0.001;AQP1：t8周末=4.475，P0.001)。结论AQP0及AQP1表达异常与糖尿病性白内障的发生、发展有关。

【关键词】水孔蛋白类;链脲菌素;免疫组织化学;白内障;糖尿病并发症

糖尿病性白内障是严重的致盲性眼病，进展较快，常常双眼同时发病。水通道蛋白(aquaporin, AQP)在眼部广泛分布，有效的水转运对维持眼的正常功能是必需的。晶状体细胞表达的AQP维持晶状体的脱水状态、透明性。本实验通过免疫组织化学技术检测AQP0及AQP1在糖尿病性白内障的表达及分布，探讨其在链脲佐菌素(STZ)-糖尿病性白内障发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物SD大鼠40只，雌雄不限，体质量(150±5)g，购自福建医科大学实验动物中心[动物合格证号：SCXKC(闽)2004 0009]。随机分为2组：对照组与糖尿病性白内障组。

1.1.2 主要试剂与仪器STZ(美国Sigma公司);兔抗鼠AQP0，兔抗鼠AQP1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，SP试剂盒(北京中杉公司)。Olympus显微镜(BH-2型，日本Olympus公司);微量快速血糖仪器(ONE TOUCH II型，美国强生医疗器材公司);HPLAS～1000高清晰彩色图像细胞测量系统(武汉同济千屏影像公司)。

1.2 方法

1.2.1 制作动物模型大鼠禁食12 h，对照组一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5);糖尿病性白内障组一次性腹腔注射2%STZ溶液(临用时以0.1 mol/L、pH 4.5的柠檬酸缓冲液配置)，剂

量为70 mg/kg。3 d后于大鼠尾静脉采血测血糖浓度，排除血糖16.7 mmol/L的大鼠。

1.2.2 观测指标及方法注射后，每周裂隙灯下观察晶状体变化1次，每2周监测血糖1次。在实验开始后2周末及8周末，对照组和糖尿病性白内障组各取动物10只(20只眼)，常规摘取眼球。将取出的眼球立即分别用10%中性福尔马林液固定，石腊包埋切片(0.3 μm)，行免疫组织化学SP二步法检测晶状体中AQP0及AQP1的表达，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判断AQP0及AQP1抗原以细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用HPLAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对AQP0及AQP1的表达进行定量分析，每个标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度，以5个视野的平均光密度的平均值作为测量值。

1.3 统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS 1

2.0软件包进行统计处理，组间比较采用成组t检验，以P0.05表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 裂隙灯观察实验过程中对照组大鼠晶状体全部透明;糖尿病性白内障组约于第2周末在晶状体周边部见到空泡，第4周末见到絮状混浊，第8周末完全混浊。

2.2 AQP0及AQP1在晶状体中的表达对照组晶状体纤维可见AQP0棕黄色阳性表达;糖尿病性白内障组2周中晶状体纤维AQP0

表达较对照组强;糖尿病性白内障组8周中晶状体纤维AQP0表达较对照组弱，组间差别均有统计学意义(AQP0：t2周末=3.598，P=0.001;t8周末=6.994，P0.001;图1～2)。晶状体上皮细胞中可见到AQP1棕黄色阳性表达;糖尿病性白内障组2周中晶状体上皮细胞AQP1表达较对照组强;糖尿病性白内障组8周中晶状体上皮细胞AQP1表达较对照组弱，组间差别均有统计学意义(AQP1：t2周末=3.103，P=0.004;t8周末=4.475，P0.001;图1～2)。

免疫组织化学SP法，DAB染色，苏木素复染，×400. A、A1：阴性对照;B、B1：对照组;C、C1：糖尿病性白内障组2周;D、D1：糖尿病性白内障组8周. A～D为AQP0;A1～D1为AQP1.

3 讨论

研究发现正常晶状体纤维可见AQP0表达，晶状体上皮细胞中可见到AQP1表达。AQP是一族介导水沿渗透压梯度被动跨生物膜转运的跨膜蛋白质，对水有高度选择性，参与晶状体的水代谢，维持晶状体的生理动态平衡和晶状体的透明性起到了重要的作用[1]。

糖尿病性白内障组早期晶状体纤维AQP0表达增强，晶状体上皮细胞AQP1表达明显增强。糖尿病性白内障由于血糖增高，血糖通过房水迅速扩散到晶状体内，使己糖激酶活性达饱和，并激活醛糖还原酶，过多的葡萄糖通过山梨醇通路转化为山梨醇和果糖，这类糖醇一旦在晶状体内产生，便不易通过囊膜渗出，从而造成山梨醇在晶状体内积聚，增加了晶状体的渗透压。高渗可刺激晶状体代偿性增加AQP，以增加对水的通透性，这是机体代偿能力的表现。AQP1具有

非常强的双向通透水分子的能力，为开放构象，其通透性可以达到脂质双分子层的10～100倍[2]。AQP0是晶状体纤维细胞膜上最多见的内在性蛋白，其空间结构形似陈列的金属杯，具有水通道蛋白家族共同的分子结构特点。与其他水孔为开放构象的水通道不同的是：AQP0是活体内已知的唯一形成膜节点的水通道，且节点上的AQP0水孔是闭合的[3]。AQP0这一特殊结构可能提示AQP0水通透作用的可调节性可能强于其他水通道。AQP1运输水需要的活化能大约为10.46 KJ/Mol，AQP0运输水需要的活化能大约为29.29 KJ/Mol，比AQP1所需的活化能高[4]。AQP0属于只对水有渗透性，对其他小分子溶质无渗透性的选择性水通道。这保证了晶状体纤维的细胞内环境稳定。高渗刺激晶状体代偿性增加AQP，使大量水分通过AQP1进入晶状体内以维持渗透压平衡，白内障的晶状体纤维肿胀，排列紊乱。由于AQP0对水分的通透性远不及AQP1强，且糖尿病时AQP0的糖基化使AQP0的构象发生改变，与对照组比较，☆：P0.05;☆☆：P0.01.

与钙调节蛋白结合能力下降[5]。因此，水分在晶状体内分布不均匀从而形成囊泡，水隙和板层分离。如果血糖降低，积聚的山梨醇和果糖缓慢地通过晶状体囊膜排出，晶状体内渗透压下降，晶状体内的水分随渗透压梯度排出，膨胀的晶状体随之缩小，近视度数降低。

糖尿病性白内障组晚期中晶状体纤维AQP0表达减弱，晶状体上皮细胞AQP1表达明显减弱。糖尿病时，晶状体囊膜的正常生理功能遭到破坏，能量代谢障碍，细胞内合成功能下降，AQP0及AQP1