枯草杆菌 生物兴趣小组

观察荚膜和鞭毛标本片
荚膜 周生
一端生一束
1.1培养基

牛肉膏蛋白胨液体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL 蒸馏水，pH 7.2—7.5 。 牛肉膏蛋白胨固体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，20g琼脂, 1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5 。
细菌鞭毛非常纤细，直径10-20nm，只能在电子显微镜下才能观察到。但采 用特殊的染色法在光学显微镜下也能见到。其原理是：在染色前先用媒染剂 处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，将鞭毛加粗，然后再进行染色，便能在油镜 下看见鞭毛的形状和着生方式。
原理
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基本原理 革兰氏染色法是一种鉴别性的染色方法。结果细胞保留 初染剂篮紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞为复染剂的 颜色（红色），则为革兰氏阴性菌。其机理是由于细菌细胞 壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。 细菌的革兰氏染色受菌龄、培养基pH值和染色技术等因 素的影响，并非固定不变。
2.枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中 的游离氧，造成肠道低氧，促 进有益厌氧菌生长，并产生乳 酸等有机酸类，降低肠道PH值， 间接抑制其它致病菌生长
研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用 于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防 和治疗烧伤面的感染。最近，科学家发现从枯草芽孢杆 菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶的不 足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维 蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。日 本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产 的，研究表明，纳豆中含有的溶栓酶(纳豆激酶)对心血管 疾病有很好的预防和治疗作用；而同样由枯草芽孢杆菌 合成的聚谷氨酸可用作药物缓释材料和医用高分子纤维 材料等。
1.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 分别以稻草粗细程度为<0.5mm,0.5～1.0mm,1.0～ 1.5mm,>1.5mm,混合样作为发酵培养基，其它组分不变，相 同发酵条件下培养48h,检测各的活菌数和芽孢率，以确定稻草 的最佳粗细程度。
1.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响 在相等的N含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母膏，豆饼粉，尿素，（NH） SO及不同组合作为N源，其它成分不变，相同条件下培养48h,检测活菌数和 芽孢率，以确定最佳N源。
1.2.5碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响 确定N源后，在保持C含量不变的情况下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉， 玉米淀粉，大米粉作为C源制作发酵培养基，其它组分不变，相同条件下培 养48h，测定活菌数和芽孢率，确定最佳C源。 1.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用 0:1,1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1,1:0的C/N比(原 料质量比)配制发酵培养基，其它成分不变，在相同的条件下 培养48h， 检测发酵料中和活菌数和芽孢率，以确定最佳的C/N比。 1.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响 改变发酵培养基中的pH值，分别以pH值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， 8.5作为发酵培养基，其它成分不变，在相同的发酵条件下培养48h，检测 活菌数和芽孢率，得最佳pH。
英文名称：Combined Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，Live 是否处方药：非处方药 剂型：颗粒 药品类型：生物制品 通用名称：枯草杆菌二联活菌颗粒 化学成分 ：每袋(1克)含活菌冻干粉37.5毫克, 内有活菌1.5亿个。
含有两种活菌—枯草杆菌和肠球菌， 可直接补充正常生理菌丛，抑制致 病菌，促进营养物质的消化、吸收， 抑制肠源性毒素的产生和吸收，达 到调整肠道内菌群失调的目的。本 品还有婴幼儿生长发育所必须的多 种维生素、微量元素及矿物质钙， 可补充因消化不良或腹泻所致的缺 乏。
3.刺激动物免疫器官的生 长发育，激活T、B淋巴细 胞，提高免疫球蛋白和抗 体水平，增强细胞免疫和 体液免疫功能，提高群体 免疫力
三、器具材料
1.器材：显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、接种环、酒
精灯、火柴、吸水纸、载破片、盖玻片。 2.染色液及试剂: 结晶紫染色液、路戈氏碘液、 95%的酒 精、番红染 色液、蒸馏水。 碱性复红染色液、5%孔雀绿染色液。 3.菌种；培养18小时至20小时的枯草芽孢杆菌、苏云金杆 菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种。 培养24小时至36小时的枯草杆菌或苏云金杆菌、 巨大芽孢杆菌。
5、 染色：将固定过的涂 片放报纸上，滴加草酸铵 结晶紫液，染1min。
6、 水洗：用水 缓慢冲洗涂片上 的染色液，用吸 水纸吸干。简单 染色结束可观察 细胞形态。
8、 脱色：吸去残留水，连续滴加 95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫 色，立即水洗。
9、 复染：滴加蕃红复染35min，水洗。
至此，革兰氏染色结束。
4．枯草芽孢杆菌菌 体自身合成α-淀粉酶、 蛋白酶、脂肪酶、纤 维素酶等酶类，在消 化道中与动物体内的 消化酶类一同发挥作 用。
枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用
枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这 决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜 力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、 纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。 在过去的10年，利用基因工程技术，枯草芽孢杆菌几乎可以 在短期内大量生产任何种源的新酶，从而省略了大量的原始菌 种改造、驯化、毒理学实验等工作；利用蛋白质工程技术， 能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良和调整，从而改善 酶的活性或者赋予酶新的所需性质。这些新技术的应用使新酶 种的开发周期大大缩短，难度和成本降低，产品更加稳定有 效。
1.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响 麦麸与稻草的比例确定以后，即可得其含水量为67%，分别以 75%，71%，63%，59%，55%代替其含水量作为发酵培养基， 在其它成分和条件不变的情况下培养48h，检测各处理后的活菌数 和芽孢率，计算得其单位质量的干重的发酵培养基的芽孢数，以 确定最佳的含水量。
水上形态 在枯草杆菌丰富的水体里，水的表面张 力比较大，可以在吹出来的泡泡的小圈 上形成一层膜。
枯草杆菌培养基
电镜图片 形态特征
革兰氏染色法
细菌介绍
芽孢具有厚而致密的壁，透性差，含水量低，折光性强，不易着色。在加 热条件下加入着色力强的染料，让芽孢、菌体与染料作用较长时间，使 芽孢染上颜色，再使菌体的颜色脱去；然后再用另一种与前者颜色不同 的对比度强的染料对菌体复染，使芽孢和菌体分别呈现出不同的颜色， 因而能更明显地衬托出芽孢，以便观察。 荚膜是一层覆盖在某些细菌细胞壁表面的粘性物质，主要成分是多糖 类。荚膜与染料的亲合力较差，不易着色。荚膜的通透性好，某些染 料可透过荚膜而使菌体着色。因此，常采用负染色法将菌体和背景着 色而荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明无色圈。
枯草杆菌
——对消化有重要作用的细菌
高一（10）班
李阳、李佩烨、项洁莹、郑铭琳
目录
1、认识枯草杆菌
2、革兰氏染色法
3、枯草杆菌的培养
4、枯草杆菌的培养
认识枯草杆菌
枯草芽孢杆菌
（枯草杆菌一般指枯草芽孢杆菌）

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭 毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～ 1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢 形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色 或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。 需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨 酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的 嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。 广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁 中繁殖，故名。
枯草杆菌的应用
在生活中的应用
……
1.枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生 的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、 短杆菌肽等活性物质，这些活性物质 对致病菌或内源性感染的条件致病菌 有明显的抑制作用
枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用
枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具 有较强的防病作用。美国用枯草芽孢杆菌 QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂 SerenadeTM，用于防治多种作物的白粉病、 霜露病、疫病、灰霉病等病害，用于防治叶部 病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根 腐病、黑斑病等)，用于防治番茄晚疫病、灰 霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。澳 大利亚开发的B.subtilis A-B对麦类和胡萝卜立 枯病等具有很好的防治和增产作用。
芽孢率的检测方法：称量大概5g 发酵48h后的培养基溶解在50mL 无菌水中,200r/min，20min摇散 得10，再用5mL无菌吸管吸取 5mL到45mL无菌水中，摇匀得10， 依次这样稀释到10，取0.02mL滴 到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘 干，然后用酚酞染色1min，用清 水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检， 找几个清晰的画面，数画面中的 芽孢数和杆数，取其平均值，即 可得到其芽孢率。
1.2.1培养方法 先用接种环接种1环试 管菌种到牛肉膏蛋白胨 液体培养基中， 200r/min，37℃培养 24h，进行扩大培养和 活化，然后再取1mL液 体种接种到发酵培养基 中，37℃培养48h。
1.2.2检测方法
活菌的检测方法：称量大概5g 发酵48h后的培养基溶解在 50mL无菌水中,200r/min， 20min摇散得10，再用5mL无菌 吸管吸取5mL到45mL无菌水中， 摇匀得10，依次这样稀释到一 个适当的稀释度，取0.1mL稀释 液到无菌牛肉膏蛋白胨固体培 养基中并涂匀，37℃培养24h， 然后数培养皿上的菌落数[7]。
1号培养基： 3g木屑, 0.4 g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。 2号培养基： 3g稻草, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。 3号培养基： 3g玉米芯, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。 4号培养基： 3g糠壳, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。
为了更好地探究枯 草杆菌繁殖的适宜 条件，对培养基进 行优化：
1.2培养基的优化 1.2.1培养方法 1.2.2检测方法 1.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响 1.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 1.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响 1.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响 1.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 1.2.8pH对枯草芽孢杆菌生长的影响
5．能合成维生素B1、 B2、B6、烟酸等多种B 族维生素，提高动物体 内干扰素和巨噬细胞的 活性。
枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用
枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多 种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体 以及有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸 等)，后分解为更小分子的有机物(氨基酸、低级脂肪酸、单糖、环烃等)， 最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，从而有效地改善水质，同时 还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。这些浮 游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供 氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多 种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖 动物的病原体。
细菌先经碱性染料结晶染 色，而经碘液媒染,在媒染 处理时，媒染剂与染料形 成不溶性化合物，可增加 染料和细菌的亲和力。
实验过程
1、 取载玻片用纱布擦干， 载玻片的一面用marker笔 画一个小圈（用来大致确 定菌液滴的位置）。涂菌 的部位在火焰上烤一下， 除去油脂。
2、 涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰 附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰 中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环， 在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜， 最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再 用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄 而均匀。 4、 固定：让菌 3、 晾干：让涂片 膜朝上，通过火 在空气中自然干燥。 焰2-3次固定 （以不烫手为 宜）。