Northern印迹杂交技术

结 果 示 例
参考书籍及文献
[1] 朱玉贤 李 毅.现代分子生物学 朱玉贤,李 现代分子生物学[M].高等教育出版 现代分子生物学 高等教育出版 社,2002，173-178. ， [2] 黄怡森 张光毅 生化与分子生物学 黄怡森,张光毅 生化与分子生物学[M].科学出版社， 张光毅.生化与分子生物学 科学出版社， 科学出版社 2008，345-347. ， [3] 郝福英 朱玉贤 朱圣庚，等.分子生物学实验技术 郝福英,朱玉贤 朱圣庚， 分子生物学实验技术 朱玉贤,朱圣庚 分子生物学实验技术[M].北 北 京大学出版社,1998,68-72. 京大学出版社 [4] 魏春红 李毅 现代分子生物学实验技术 魏春红,李毅 现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 李毅.现代分子生物学实验技术 高等教育出版 社,2006,156-162. [5] 汪天虹 分子生物学实验 汪天虹.分子生物学实验 分子生物学实验[M].北京大学出版社 北京大学出版社,2009,76-79. 北京大学出版社
• 在黑暗条件下将膜与显色液放入密封 的暗盒中显色。 min后出现颜 的暗盒中显色。通常 2 min后出现颜 充分显色应在16 h以上 以上。 色，充分显色应在16 h以上。膜可以 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。 • 显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照 显色完毕后用TE缓冲液停止染色， TE缓冲液停止染色 相记录显色结果。 相记录显色结果。
northern 印迹杂交流程图
所用材料、 所用材料、试剂及仪器 Βιβλιοθήκη Baidu 法 与 步 骤 参考书籍及文献
材料
总RNA样品或mRNA样品、 探针模板DNA、随机引物、地高辛dUTP、klenow酶、硝酸纤维素虑膜 等。
试剂
• 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样 缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、 20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液 (2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝 )、 BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、 显色液、琼脂糖等。
5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
分子生物学方法之
Northern 印迹杂交技 术
原
理
• 核酸分子杂交（molecular 核酸分子杂交（ hybridization）： ）：利用不同来源但互补配 hybridization）：利用不同来源但互补配 对的核酸单链之间(包括DNA DNA,DNA-RNA， DNA对的核酸单链之间(包括DNA-DNA,DNA-RNA， RNA-RNA)能够特异性结合形成杂合双链的 RNA-RNA)能够特异性结合形成杂合双链的 特性， 特性，从而对目的核酸分子进行定性和定 量分析的技术。 量分析的技术。 • Northern Blotting: 检测RNA 检测RNA
室温 3h
75° 75°C 保温10 保温10 Min。 Min。
1000r/min 15min、 15min、 去上清 加预冷 、乙醇洗 -20 无水乙 涤、真 醇、混 ℃、 空干燥 匀。 TE溶解 2 h 、TE溶解 20° 、-20°C 备用。 备用。
4.杂交 4.杂交
• 将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 将待杂交的滤膜放入杂交袋中， 滤膜计算加入预杂交液、 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交液、 68℃水浴摇床杂交 水浴摇床杂交1 h。 68℃水浴摇床杂交1-2 h。 • 将标记好的DNA探针煮沸5min，迅速在 将标记好的DNA探针煮沸5min DNA探针煮沸5min， 冰上冷却。 冰上冷却。将探针加入预热的杂交液 充分混匀。 中，充分混匀。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
室温转移10 10—25h 电泳后的凝胶 → 放置 → 室温转移10 25h → 漂洗（SSC）除碎胶片 →80℃烘烤2h固定 漂洗（SSC） 80℃烘烤2h固定 烘烤2h 核酸. 核酸.
3、探针标记
探针模 模板、 模板、随 机引物 、双蒸 水。 冰块 离心、 离心、 混匀。 混匀。 变性
顺序加 随机引 缓冲液 、dNTP 、dUTP Klenow 酶，混 匀。
上样
用标尺测量加样 孔与条带的距离 ，拍照
切去凝胶一角，用 用SSC冲洗并浸泡 胶板，以除去甲醛 。
电泳：用1*MOPS缓冲液 ，先用20V使样品进胶， 再用5V/cm电泳1 h ，停 止电泳。
2.转膜 2.转膜
浸泡在250 ml 50 浸泡在 Mmol/l NaOH ,室 室 温、30r/min 30 min。
仪器
• 恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移 仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇 床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液 器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯， 量筒，三角瓶，紫外灯等。
1.RNA电泳 1.RNA电泳
琼脂糖与纯水一定 比例于微波炉内混 匀、冷却到75°C 加mops缓冲液、 甲醛，混匀。 制备成电泳用胶 待胶凝过程中， 准备RNA样品。
• 倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计算 倒去预杂交液， 250mL/c㎡ 向杂交袋中加入含地高辛标记探针的 杂交液，68℃杂交 h以上 杂交6 以上。 杂交液，68℃杂交6 h以上。 • 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC，0.1% 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 溶液洗膜两次以上， min。 SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。 膜即可以立即用于显色检测或储存备 干燥环境中）。 用（干燥环境中）。
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。
浸泡在250ml 浸泡在 10*SSC约 10*SSC约1min 。
RNA转膜前的处理 RNA转膜前的处理
毛细管洗脱法 转膜的 方法 真空转移法 电印迹法
叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡， 叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。