第七章 分子荧光法
第七章 分子发光-荧光与磷光解读

激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移 在溶液中,分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激 发)光谱的波长长,荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量,
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
S1
迟 滞 荧 光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级 之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S2
磷 光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射 瑞利散射 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度:M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1); 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则),三重态能级比相应单 重态能级低;
大多数有机分子的基态处于单重态;
S0→T1 禁阻跃迁;
通过其他途径进入
分子荧光分析法基本原理

分子荧光分析法基本原理一. 分子荧光的发生过程(一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=2份112;+(-2份112;)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,称“单线态”;图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C)当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即ÄS=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”;如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1:S=1/2+1/2=1 其多重性:M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”;“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的,即跃迁几率非常小,只相当于单线态→ 单线态过程的10-6~10-7。
(二)分子去活化过程及荧光的发生:(一个分子的外层电子能级包括S0(基态)和各激发态S1,S2,…..,T1…..,每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级)处于激发态的分子不稳定,在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量(辐射或非辐射跃迁)回到激态,这个过程称为“去活化过程”,这些途径为:1. 振动弛豫:在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫。
图2 分子吸收和发射过程的能级图2. 内转换:当激发态S2 的较低振动能级与S1 的较高振动能级的能量相当或重叠时,分子有可能从S2 的振动能级以无辐射方式过渡到S1 的能量相等的振动能级上,这一无辐射过程称为“内转换”。
分子荧光光谱法

分子荧光光谱法分子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术,它可用于测定溶液中分子结构、组成、组分和吸收特性,以及提供关于反应机理的许多信息。
它被广泛应用于化学研究、生物研究、环境研究和制药技术等多个领域。
荧光光谱反应的本质是,一些物质能够从激发态吸收来自外部光源的一定能量,并从激发态到低能量的稳定态跃迁,从而释放出某种光,而这些释放出来的光就是荧光光谱。
基本原理在分子荧光光谱中,激发态是将能量投射到分子上,使其进入一种不稳定的、能量较高的激发态,然后分子会自动以一定的速率从这种高能态向低能态跃迁,跃迁过程中会释放出一定能量的荧光光谱。
具体而言,当激发态的分子能量超过一定的最低能量时,它将进入具有较低能量的稳定态,从而释放出光子。
通常说,这些释放出的光子的频率与激发态的能量有关。
应用分子荧光光谱法可以用于识别、测定和分离不同物质,它可以用于研究有机物、无机物、金属离子和药物,也可用于检测有毒物质。
分子荧光光谱法还可以用于研究分子间相互作用、分子构型变化和反应机理等问题,可以用来研究复杂有机化合物中的加合反应,也可以用来研究金属离子与有机物之间的相互作用。
优缺点分子荧光光谱法具有灵敏度高、分析结果准确、操作简单、检测范围广等优点,可用于大量的物质的有效分析。
此外,它还具有自动控制设备、能测出大量小浓度物质等优点。
然而,分子荧光光谱法也有一些缺点,比如它只能测量没有涂料、沉淀物和色素的物质,而且只有在激发态跃迁释放出荧光时,它才能完成光谱测量。
结论分子荧光光谱法是一种广泛应用的分析技术,它具有敏锐的测量特性,可以快速、准确地测量多种物质,因此被广泛应用于诸多研究领域。
不仅如此,它的测量过程还简单易行,使它可以成为一个非常有用的分析工具。
分子荧光分析法ppt

发展历程
1
分子荧光分析法的发展历程可以追溯到20世纪 初,当时科学家们开始研究荧光现象。
2
在20世纪50年代,随着荧光光谱仪的发明,分 子荧光分析法得到了广泛应用。
3
近年来,随着高灵敏度检测设备和技术的发展 ,分子荧光分析法在生物、医学、环境等领域 得到了越来越广泛的应用。
全自动化设备
实现样本自动进样、分析、数据处 理和结果输出等功能。
分析方法改进
优化荧光探针
改进荧光探针的设计,提高其 灵敏度和特异性。
多元分析方法
结合多种分析技术,形成多元 分析方法,拓展分析范围。
实时动态监测
实现实时、原位监测,提高分 析的及时性和可靠性。
06
结论与展望
研究成果总结
分子荧光分析法在生物样品检测方面具有较高 的灵敏度和选择性,能够实现对多种生物分子 的同时检测。
物样品检测。
在未来,分子荧光分析法将会在更多的领域得到 应用,如生物医药、环境监测、食品安全等,为
人类的生活和健康提供更可靠的保障。
THANKS
感谢观看
研究生物分子的结构和功能 检测生物样品中的基因突变 检测药物在生物体内的代谢过程
在化学分析中的应用
研究化学反应的动力学过程 分析化学合成中的产物
检测化学试剂的纯度和杂质含量
04
分子荧光分析法的优缺点
优点
选择性强
灵敏度高
荧光分析法对某些物质的选择性较高,可以 较为准确地测定某些特定的物质,适用于复 杂基质样品的检测。
荧光分析法的仪器设备相对昂贵,实验成本较高,需 要专业的技术人员进行操作和维护。
第七章 分子发光分析

如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值,化合物所处状态不同,不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物, 一方面pH会影响鏊合物的形成,另一方面还会 影响鏊合物的组成,因而影响它们的荧光性质。 如:苯酚在酸性溶液中呈现荧光,但在碱性 溶液中,无荧光。
浓度范围为:10-5μg/ml~100μg/ml 。对于较 浓溶液,由于猝灭现象和自吸收等原因,使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
(2)影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说,随着溶剂介电常数的增大,荧光 峰的波长越大,荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞,使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态,产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭(组成化合物的猝灭) 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁,由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光,它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞,形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子,使荧光猝灭。
卫生化学笔记:分子荧光分析法

分子荧光分析法物质吸收外界能量后,其电子能级由基态跃迁到激发态,物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量,之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级,并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级,此时,分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法:通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度,对物质进行定性和定量分析的方法。
(一)基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态:当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中,一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋(自旋量子数S分别为1/2和 -1/2),即总自旋量子数S为0,分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态:当物质受到光照射,吸收紫外光或可见光时,物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化,即总自旋量子数S为0,分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态:当物质受到光照射,吸收紫外光或可见光时,物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化,即分子具有两个自旋平行的电子,其总自旋量子数S为1,分子中电子能级的多重度M=2S+1=3,则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫:同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞,以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移:两个电子能级非常接近时,电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级,此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射:处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移,回到第一电子激发单线态的最低振动能级,以辐射的形式回到基态的各个振动能级,此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越:受激发分子的电子在激发态发生自旋反转,使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态(S1)跃迁至第一激发三线态(T1),使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子荧光分析法

作用:鉴别荧光物质; 选择适当的荧光测定波长。
激发光谱和荧光光谱类似“镜像对称”关系
荧 光 强 度
300nm
400nm
500nm
硫酸奎宁的激发光谱(虚线)及荧光光谱(实线)
3 溶液荧光光谱的特征
A 斯托克斯位移:Stokes shift
1852年,Stokes首先观察到:溶液荧光光谱中, 荧光波长总是大于激发光波长。
V0
V
V
3
2
V1
T1
V0
S0
V
V
3
2
V1
V0
荧光与磷光产生示意图
发射荧光过程约为 109,1返07回S基态 时,可停留在任一振动能级上,因此,可得几
个非常靠近的荧光峰谱线。
有关概念: ① 振动弛豫:vbrational relexation
物质分子被激发后,其电子可能跃迁到第一电 子激发态或更高的电子激发态的几个振动能级 上,在溶液中,激发态分子通过与溶剂分子碰 撞而将部分振动能量传递给溶剂分子,其电子 则返回到同一电子激发态的最低振动能级上, 此过程称为~。
② 内转换:internal conversion
当两电子激发态之间能量相差较小以致其振动 能级有重叠时,受激分子将多余的能量转变为 热能而跃迁至较低电子能级。
③ 荧光发射:
无论分子最初处于哪一个激发单线态,通过内 转换及振动弛豫,均可返回至第一激发单线态 的最低振动能级上,然后再以辐射形式发射光 量子而返回到基态的任一振动能级上,所发射 的光量子即
称荧光。
荧光的波长总比激发光的波长要长?
④ 外转换:external conversion 如果分子在溶液中被激发,激发态分子与溶 剂分子及其它溶质分子之间相互碰撞而失去能 量,以热能形式放出,此过程称为外转换。 通常发生在第一激发单线态或第一激发三线 态的最低振动能级向基态转换的过程中,会降 低荧光或磷光强度。
分子荧光光度法

分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理,通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中,首先需要选择一个适合的激发波长,以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时,样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时,分子会发生非辐射跃迁,即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比,因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先,它具有高灵敏度和高选择性,可以检测到极低浓度的物质。
其次,它具有快速和简便的特点,可以在短时间内完成测定。
此外,分子荧光光度法还具有广泛的应用领域,包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而,分子荧光光度法也存在一些限制。
首先,荧光信号受到许多因素的影响,如环境条件、荧光染料的性质等。
因此,在进行分子荧光光度法测定时,需要对这些因素进行严格的控制。
其次,某些样品可能会产生背景荧光干扰,这会降低测定的准确性。
因此,需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法,它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施,可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
分子荧光分析法教学课件

应用领域与优势
应用领域
分子荧光分析法广泛应用于生物、医学、环境等领域,如生物体内的物质检测、医学诊断、环境污染物监测等。
优势
分子荧光分析法具有高灵敏度、高选择性、非破坏性等特点,能够实现快速、准确地检测物质,尤其适用于痕量 物质的检测。此外,荧光分析技术还可以与其他技术联用,如色谱分离技术、质谱技术等,进一步提高检测的准 确性和可靠性。
发展历程与现状
发展历程
分子荧光分析法自20世纪初诞生以来,经历了多个发展阶段 ,包括荧光物质的发现、荧光分析技术的建立、荧光探针的 应用等。
现状
目前,分子荧光分析法已经成为一种广泛应用于生物、医学 、环境等领域的高灵敏度、高选择性的分析方法。随着技断提高。
将荧光分析法应用于生物、医学、环境等领域, 拓展其应用范围。
创新技术
不断探索新的荧光分析技术,提高检测效率和准 确性。
加强交叉融合
与化学、物理、生物等领域进行交叉融合,推动 荧光分析法的创新发展。
THANKS 感谢观看
微型化
将荧光分析法应用于微流控芯 片和纳米材料中,实现微型化
、便携式检测。
荧光分析法面临的挑战与机遇
挑战
荧光分析法的干扰因素较多,如光散 射、背景荧光等,需要克服这些干扰 以提高检测准确性。
机遇
随着新材料、新技术的不断涌现,荧 光分析法将有更多的应用领域和潜在 市场。
荧光分析法的未来发展方向
拓展应用领域
分子荧光分析法教学课件
• 分子荧光分析法概述 • 荧光分析法的基本原理 • 荧光分析法的分类 • 荧光分析法的实验技术
• 荧光分析法的应用实例 • 荧光分析法的未来展望
01 分子荧光分析法概述
定义与原理
仪器分析课件第7章-分子发光分析法

2. 无辐射跃迁
当激发态分子返回基态时,如果不伴有发光现象, 该过程称为无辐射去激或无辐射跃迁,该过程包括振
动弛豫(VR) 、内转换(IC)和系间窜跃(ISC)。
小结:分子荧光和磷光的产生
电子处于激发态是不稳定状态,返回基态时,通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量; 传递途径
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 : • If = I a • 由朗-比耳定律: Ia = I0(1-10- b c ) • If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c ) • 浓度很低时,将括号项近似处理后: • If = 2.3 I0 b c = Kc
离状态改变,则荧光波长和荧光强度也会发生改变。
(2)温度的影响
一般来说,大多数荧光物质的溶液随着温度降低,荧 光效率和荧光强度将增加;反之,温度升高荧光效率则下
降。
如荧光素的乙醇溶液在 0º C 以下每降低 10º C ,荧光效 率增加3%,冷至-80º C时,荧光效率为100%。
这是因为温度降低时,溶液中分子的活动性减弱,溶
• 化学发光是由化学反应提供的能量激发物质产生
的光辐射。
• 发生于生物体的化学发光,称为生物发光。
• 利用化学发光而建立起来的方法,称为化学发光
分析法。
7-5-1 化学发光分析法的基本原理
1. 化学发光分析法的基本原理
化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能,而使反应 产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光反应都应 包括化学激发和发光两个步骤。
• 分子受光子激发后,由第一电子激发单重态回到基态的任 一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。
• 激发态分子从第一激发三重态 回到基态伴随的光辐射称为 磷光。 • 分子受化学能激发后产生的发光现象称为化学发光。
分子荧光法原理范文

分子荧光法原理范文分子荧光法是一种常用的分析方法,用于测定物质的浓度、纯度、反应速率等。
其原理是基于分子在光的激发下,吸收能量后进入激发态,随后再通过辐射发射出特定波长的光。
这种发射光的特性可以用于测定物质的性质和浓度。
分子荧光的原理可以通过两个基本过程来解释:激发和发射。
激发是指分子从基态(低能量态)通过吸收光能转变为激发态(高能量态)。
发射是指分子从激发态通过辐射发射出相应波长的光能回到基态。
在分子荧光法中,首先需要用一个激发源来提供能量,例如紫外线灯或激光器。
这些能量会被样品中的分子吸收,并将其激发到一个较高的能级。
一旦分子处于激发态,其平均寿命会受到能级布居度的影响。
这意味着在光激发源关闭后,分子将从激发态返回到基态的速率将决定发射出的光的强度。
1.斯托克斯位移:当分子处于激发态时,其能级处于较高能量。
在发射过程中,分子会从高能量的能级跃迁回到较低的能级,释放出温度较低的光子。
这个过程称为斯托克斯位移。
斯托克斯位移导致荧光光谱的峰值波长比激发光谱的波长长。
2.光谱分析:通过测量发射光的波长和强度,可以了解分子的特性。
分子具有特定的发射光谱,其峰值波长和强度与分子的结构和环境有关。
通过对发射光谱的分析,可以确定物质的浓度、纯度以及其他性质。
3.荧光寿命测量:荧光寿命是指分子从激发态返回到基态所需的时间。
不同的分子拥有不同的荧光寿命,可以通过测量荧光的寿命来确定分子的浓度和性质。
荧光寿命测量需要使用荧光寿命仪,该仪器可以测量荧光的衰减速率,从而获得荧光的寿命。
4.荧光猝灭:荧光猝灭是指在一些条件下荧光强度减弱的现象。
猝灭可以通过分子间的相互作用(例如吸附、化学反应等)来实现。
荧光猝灭可以用于表征分子的相互作用,测定反应速率等。
分子荧光法在化学、生物、医学等领域都有广泛的应用。
例如,荧光标记技术是一种常用的生物分析方法,通过将荧光染料与特定分子标记在一起,可以实现对分子的追踪和分析。
此外,分子荧光法还可以用于药物筛选、污染物检测、环境监测等方面。
分子荧光光谱法 ppt课件

Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 (通常是紫外线)照射,吸收光能后 进入激发态,并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光(通常 波长在可见光波段);而且一旦停止 入射光,发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
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26
溶液浓度较低时:
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 : F=Kc
即: 在低浓度时,溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
(1)内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
(1)镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关,而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下,基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的,通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
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ppt课件
42
(2)Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程(系 间窜越、外转换、内转换)的速率常数减小的因 素(环境因素和结构因素)都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射,荧光强度 (F)与
第七章分子发光荧光和磷光

❖ 19世纪以前,荧光的观察是靠肉眼进行的,直到1928Jette和 West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发
射
磷 振动弛豫 光
S0
l3 l 1 分子吸收l 2和发射l 过2 程的Jablonski能级图
非辐射能量传递过程
振动弛豫:在凝聚相体系中,被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通 过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的 分子,而自身返回该电子能级的最低振动能级,这个过程称为振动弛 豫。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换:当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠 时,分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的 振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10 -12 s。 内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。
?直到1852年年stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光而不是由光的漫射作用所引起的从而导入了荧光是光发射的概念他还由发荧光的矿石萤石推演而提出荧光这一术语
第七章分子发光荧光和磷光
§7.1 分子发光的基本原理
分子荧光法

当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时,便产生分 子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法。
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下 几类: 光致发光:以光源来激发而发光 发射
电致发光:以电能来激发而发光 生物发光:以生物体释放的能量激发而发光 化学发光:以化学反应能激发而发光
最大荧光波长(em) :光 谱上荧光强度最大的波长。
萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
荧光物质的最大激发波长(ex)和最大发射波长(em) 是鉴定物质的根据;也是定量测定最为灵敏的条件。
荧光光谱的特征 1、荧光光谱与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态能级,但均回到第一激发 单重态的最低振动能级再跃迁回到基态,从而荧光 发射光谱只有一个发射带,而且荧光光谱的形状与 激发波长无关。 2、荧光波长比激发波长较长: 荧光发射能量以激发能量低,故荧光发射波长总 是大于激发光谱波长,这种现象又称红移。
当abc 0.05时,F 2.3kI0abc K' C
F K' C
(荧光定量分析法的依据)
结论:对某一物质的稀溶液(A=abc<0.05),在 一定条件下,当激发光波长、强度和液层厚度固 定时,物质发出的荧光强度与该溶液的浓度呈正
比。
五、影响荧光强度的外部因素 (一)溶剂的影响
外部能量转换(external conversion):激发分子与
溶剂或其他溶质分子之间相互碰撞失去能量,并
以热能的形式释放能量的过程。外转换使荧光或
磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越(intersystem crossing):处于激发态分 子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程;分子由激发单重态通过体系间跨越到
分子荧光光谱法

分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法,即通常所谓的荧光分析法。
法。
该法是一种利用某一波长的光线照射试样,该法是一种利用某一波长的光线照射试样,该法是一种利用某一波长的光线照射试样,使试样吸收这一辐射,使试样吸收这一辐射,使试样吸收这一辐射,然后在发然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。
如果这种再发射约在 s 内发生,则称为荧光;若能在生,则称为荧光;若能在 s 或更长的时间后发生,则称磷光。
分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。
荧光分析法的突出优点是灵敏度高,其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。
级。
选择性也比分光光度法好,选择性也比分光光度法好,选择性也比分光光度法好,但其应用不如分光光度广泛,但其应用不如分光光度广泛,但其应用不如分光光度广泛,因为只有有限数量因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。
的化合物才能产生荧光。
一、基本原理一、基本原理(一)(一) 荧光光谱的产生荧光光谱的产生荧光物质分子吸收了特定频率辐射后,荧光物质分子吸收了特定频率辐射后,由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态(或更(或更高激发态)高激发态)的任一振动能级,的任一振动能级,的任一振动能级,在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞,在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞,在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞,以以热的形式损失部分能量后,而回到第一电子激发态的最低振动能级(无辐射跃迁)。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级,然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级,便产生荧光。
便产生荧光。
由于无辐射跃迁的几率大,因此分子荧光波长常常比激发光长。
因此分子荧光波长常常比激发光长。
激发光源的波长通常是激发光源的波长通常是在紫外区,在紫外区,荧光也可能在紫外区,荧光也可能在紫外区,荧光也可能在紫外区,但更多是在可见区。
第七章-分子荧光法

第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后,其电子从基态跃迁到激发态,如果在返回基态的过程中伴随有光辐射,这种现象称为分子发光(molecular luminescence),以此建立起来的分析方法,称为分子发光分析法。
物质因吸收光能激发而发光,称为光致发光(根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光);因吸收电能激发而发光,称为电致发光;因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光,称为化学发光或生物发光。
根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同,分子发光分析法通常分为荧光分析法,燐光分析法和化学发光分析法。
荧光分析法历史悠久。
早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes,就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中,呈现出极为可爱的天蓝色,但未能解释这种荧光现象。
直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时,用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光,才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光,从而导入了荧光是光发射的概念,并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语,他还论述了Stokes 位移定律和荧光猝灭现象。
到19世纪末,人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。
近十几年来,由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入,大大推动了荧光分析理论的进步,促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展,加速了各种新型荧光分析仪器的问世,进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性,解决了生产和科研中的不少难题。
目前,分子发光分析法在生物化学,分子生物学,免疫学,环境科学以及农牧产品分析,卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。
第七章分子发光荧光与磷光

共振光散射
瑞利散射
二级共振光散射
拉曼光
三级共振光散射
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
l
三. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系
1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系
光吸收定律(Lambert – Beer Law)
电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态( 多为 S1→ S0
跃迁),发射波长为 l’2的荧光; 10-7~10 -9 s 。
由图可见,发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长
长; l’2 > l 2 > l 1 ;
磷光发射:激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后,并经 过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上, 从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。
❖ 19世纪以前,荧光的观察是靠肉眼进行的,直到1928年,才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
由分子结构理论,主要讨论荧光及磷光的产生机理。
如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子,即单重态到三重态的 跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。 这种跃迁是“禁阻”的。
改变电子自旋,禁阻跃迁,通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射:当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时,分 子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可 能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上,这个过程 称为荧光发射。
分子荧光分析法简介课件

荧光光谱的测量
总结词
荧光光谱的测量是荧光分析中的重要环节,通过测量可以得到待测物的荧光发射光谱和 激发光谱。
详细描述
在测量荧光光谱时,需要使用光谱仪在特定的激发波长范围内扫描,记录待测物的荧光 发射光谱和激发光谱。同时,还需控制实验条件,如温度、溶剂等,以确保测量结果的
准确性和可靠性。
荧光量子产率的测定
荧光寿命的测定有助于了解荧光染料的发光 持续时间和能量衰减规律,有助于深入理解 荧光分析的原理和应用。
详细描述
荧光寿命的测定通常使用脉冲或时间相关偏 振光谱技术进行。通过测量染料在不同时间 点的荧光强度,可以计算出荧光寿命。该参 数对于优化实验条件、提高荧光分析的灵敏
度和特异性具有指导意义。
CHAPTER 05
CHAPTER 03
分子荧光分析法的分类
荧光分光光度法
总结词
一种常用的荧光分析方法,通过测量荧光光谱和荧光强度,对荧光物质进行定性和定量分析。
详细描述
荧光分光光度法基于荧光物质在不同波长光的激发下会发出不同波长的荧光原理,通过测量荧光光谱和荧光强度 ,可以确定荧光物质的成分和浓度。该方法具有高灵敏度、高选择性等优点,广泛应用于生物、医学、环境等领 域。
时间分辨荧光分析法
总结词
一种高灵敏度的荧光分析方法,通过测量荧光物质在不同时间点的荧光强度,对荧光物质进行定性和 定量分析。
详细描述
时间分辨荧光分析法利用荧光物质在不同时间点的荧光特性,通过测量不同时间点的荧光强度,可以 消除背景荧光的干扰,提高检测的灵敏度和准确性。该方法具有高灵敏度、高分辨率等优点,在生物 、医学、环境等领域有广泛应用。
分子荧光分析法的应用实例
在环境监测中的应用
分子荧光分析法实验

一、分子荧光分析法简介
原子光谱(略) 光 谱 分 析 分子 光谱 分子发光 UV-Vis(紫外-可见) 分子吸收
(对光的吸收)
IR(红外)
光致发光 荧光、磷光 其它发光形式 如:化学发光等
1.1 荧光的产生
• 当被测物质受到光照后,被测物分子吸收了 具有特征频率的辐射能,分子从基态上升到激发 态,分子在较高能级的激发态时,它可能处于激 发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过 与溶剂分子,同类分子或其他分子的碰撞,而失 去振动能级,降低至激发态时的最低振动能级, 在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低 振动能级,即第一电子激发态的最低振动能级降 落至基态的各个不同的振动能级时,则以光的形 式辐射出能量,所辐射出的光即是荧光。
4. 参数设定: “定量测定”界面模式下,点击“Configure”主菜单, 在下拉菜单中选择“Parameters”菜单,则会自动弹出 “Quantitative Parameters”窗口,在此窗口中,需要设 置以下五个参数: 在“EX Wavelength”中填 270, 在“EM Wavelength”中填 525, 在“Slit Width[nm] EX”中填 10, 在“Slit Width[nm] EM”中填 10, 在“Sensitivity: High Low” 中选 Low,其他参数 选默认值,不要调整它们,参数设置好后,按“OK” 此时软 件自动回到“定量测定”界面模式。此时仪器参数设置完毕。
3 S0 2 1 V =0
分子内的激发和衰变过程
1.2 荧光光谱
• 当固定激发光波长和强度不变, 而记录荧光强度随波长变化的曲线, 称为荧光光谱。若固定荧光最强处的 荧光波长不变而改变激发光波长,记 录荧光强度随激发光波长变化的曲线, 称为激发光谱。
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第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后,其电子从基态跃迁到激发态,如果在返回基态的过程中伴随有光辐射,这种现象称为分子发光(molecular luminescence),以此建立起来的分析方法,称为分子发光分析法。
物质因吸收光能激发而发光,称为光致发光(根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光);因吸收电能激发而发光,称为电致发光;因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光,称为化学发光或生物发光。
根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同,分子发光分析法通常分为荧光分析法,燐光分析法和化学发光分析法。
荧光分析法历史悠久。
早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes,就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中,呈现出极为可爱的天蓝色,但未能解释这种荧光现象。
直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时,用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光,才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光,从而导入了荧光是光发射的概念,并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语,他还论述了Stokes位移定律和荧光猝灭现象。
到19世纪末,人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。
近十几年来,由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入,大大推动了荧光分析理论的进步,促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展,加速了各种新型荧光分析仪器的问世,进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性,解决了生产和科研中的不少难题。
目前,分子发光分析法在生物化学,分子生物学,免疫学,环境科学以及农牧产品分析,卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。
第二节分子荧光分析法的基本原理一、荧光(燐光)光谱的产生物质受光照射时,光子的能量在一定条件下被物质的基态分子所吸收,分子中的价电子发生能级跃迁而处于电子激发态,在光致激发和去激发光过程中,分子中的价电子可以处于不同的自旋状态,通常用电子自旋状态的多重性来描述。
一个所有电子自旋都配对的分子的电子态,称为单重态,用“S”表示;分子中的电子对的电子自旋平行的电子态,称为三重态,用“T”表示。
电子自旋状态的多重态用2S+1表示,S是分子中电子自旋量子数的代数和,其数值为0或1。
如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对时,即S=0,多重态2S+1=1,该分子体系便处于单重态。
大多数有机物分子的基态是处于单重态的,该状态用“S0”表示。
倘若分子吸收能量后,电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化,这时分子处于激发单重态;如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变,这时分子便具有两个自旋平行(不配对)的电子,即S=1,多重态2S+1=3,该分子体系便处于激态三重态。
符号S0、S1、S2分别表示基态单重态,第一和第二电子激发单重态;T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。
处于激发态的分子是不稳定的,它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程丧失多余的能量而返回基态。
辐射跃迁的去活化过程,发生光子的发射,伴随着荧光或燐光现象;无辐射跃迁的去活化过程是以热的形式辐射其多余的能量,包括内转化(ic),系间窜跃(isc)、振动弛豫(V R)及外部转移(ec)等,各种跃迁方式发生的可能性及程度,与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。
假设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后,分别激发至第二激发单重态S2及第一激发单重态S1,图9-1示意了分子内所发生的各种光物理过程。
振动弛豫它是指在同一电子能级中,电子由高振动能级转至低振动能级,而将多余的能量以热的形式放出。
发生振动弛豫的时间为10-12S数量级。
图9-1中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况。
内转移当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时,常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低能级。
图9—1所示,处于高激发单重态的电子,通过内转移及振动弛豫,均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
荧光发射处于第一激发单重态最低振动能级的电子跃回至基态各振动能级时,所产生的光辐射称为荧光发射,将得到最大波长为λ3的荧光。
注意基态中也有振动弛豫跃迁。
很明显,λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长,而且不论电子开始被激发至什么高能级,最终将只发射出波长λ3的荧光。
荧光的产生在10-6~10-9S内完成。
系间窜跃指不同多重态间的无辐射跃迁。
如:S1→T1。
通常,发生系间窜跃时,电子由S1的较低振动能级转移到T1的较高振动能级处。
有时,通过热激发,有可能发生T1→S1,然后由S1发生荧光,即产生延迟荧光。
燐光发射电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小,因为这是禁阻跃迁。
但是,由第一激发单重态的最低振动能级,有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态,再经过振动弛豫,转至其最低振动能级,由此激发态跃回至基态时,便发射燐光。
这个跃迁过程(T1→S0)也是自旋禁阻的,其发光速率较慢,约为10-4~10s。
因此,这种跃迁所发射的光,在光照停止后,仍可持续一段时间。
外部转移指激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移,使荧光或燐光强度减弱甚至消失。
这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。
二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线任何荧光化合物,都具有两种特征的光谱:激发光谱和发射光谱。
荧光激发光谱(或称激发光谱),就是通过测量荧光体的发光强度随激发光波长的变化而获得的光谱,它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。
激发光谱的具体测绘办法,是通过扫描激发单色器以使不同波长的入射光激发荧光体,然后让所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上,由检测器检测相应的荧光强度,最后通过记录仪记录荧光强对激发光波长的关系曲线,即为激发光谱。
从理论上说,同一物质的最大激发波长应与最大吸收波长一致,这是因为物质吸收具有特定能量的光而激发,吸收强度高的波长正是激发作用强的波长。
因此,荧光的强弱与吸收光的强弱相对应,激发光谱与吸收光谱的形状应相同,但由于荧光测量仪器的特性,例如光源的能量分布、单色器的透射和检测器的响应等特性都随波长而改变,使实际测量的荧光激发光谱与吸收光谱不完全一致。
只有对上述仪器因素进行校正之后而获得的激发光谱,即通常所说的“校正的激发光谱”(或“真实的激发光谱”)才与吸收光谱非常近似。
如使激发光的波长和强度保持不变,而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上,扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度,然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线,所得到的谱图称为荧光发射光谱(简称荧光光谱)。
荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。
荧光光谱可供鉴别荧光物质,并作为在荧光测定时选择适当的测定波长或滤光片的根据。
和激发光谱的情况类似,在一般的荧光测定仪器上所测绘的荧光光谱,属“表现”的荧光光谱,只有对光源、单色器和检测器等元件的光谱特性加以校正以后,才能获得“校正”(或“真实”)的荧光光谱。
溶液荧光光谱通常具有如下特征:1、斯托克斯位移斯托克期在1852年首次观察到荧光波长总是大于激发光波长,这种波长移动的现象称为斯托克斯位移。
2、荧光发射光谱的形状与激发光波长无关分子的电子吸收光谱可能含有几个吸收带,而其荧光光谱却只含一个发射带。
激发光波长改变,可能将分子激发到高于S1的电子能级,但很快经过内转移和振动弛豫跃迁到S1态的最低振动能级,然后产生荧光。
由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级,而与荧光体被激发到哪一个电子态无关,所以荧光光谱的形状通常与激发光波长无关。
3、荧光光谱与吸收光谱的镜像关系基态分子通常处于最低振动能,受激时可以跃迁到不同的电子激发态,会产生多个吸收带,其中第一吸收带的形成是由于基态分子被激发到第一电子激发单重态的各不同振动能级所引起的,因而第一吸收带的形状与的形状与第一电子激发单重态中振动能级的分布情况有关;荧光光谱的形成是激发分子从第一电子激发单重态的最低振动能级辐射跃迁至基态的各个不同振动能级所引起的,所以荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布情况(即能量间隔情况)有关。
一般情况下,基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的,且荧光带的强弱与吸收带强弱相对应,因此,荧光光谱和吸收光谱的形状相似。
另外,在第一吸收带中,S 1态的振动能级越高,与S 0态间的能量差越大,吸收峰的波长越短;相反,荧光光谱中S 0态的振动能级越高,与S 1态间的能量差越小,发射荧光的波长越长。
所以,荧光光谱和吸收光谱的形状虽相似,却呈镜像对称关系。
图9—2是蒽分子的吸收光谱和荧光光谱。
不同的荧光物质结构不同,S 0与S 1态间的能量差不一样,基态中各振动能级的分布情况也不一样,所以有着不同形状的荧光光谱,据此可以进行定性分析。
三、荧光的影响因素1、荧光的影响因素荧光量子产率(ϕ),定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值,即吸收的光子数发射的光子数=ϕ 激发分子总数发射荧光的分子数或=ϕ 荧光量子产率有时也叫荧光效率,ϕ反映了荧光物质发射荧光的能力,其值越大物质的荧光越强。
前面已经提到,在产生荧光过程中,涉及到辐射和无辐射跃迁过程,如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。
很明显,荧光的量子产率,将与上述每一个过程的速率常数有关。
若用数学式来表达这些关系,得到i f fK k k ∑+=ϕ式中f k 为荧光发射过程的速度常数,i K ∑为其它有关过程的速率常数的总和。
显然,凡是能使f k 值升高而使其它k 值降低的因素,都可增强荧光。
假如非辐射跃迁的速度远小于辐射跃迁的速度,即i K ∑《f k ,荧光量子产率的数值便接近于1。
在通常情况下,ϕ的数值总是小于1。
不发荧光的物质,其荧光量子产率的数值为零或非常接近于零。
一般说来,f k 主要取决于化学结构,而i K ∑则主要取决于化学环境,同时也与化学结构有关。
2、荧光与化合物结构的关系了解荧光与分子结构的关系,可以预示分子能否发光,在什么条件下发光,以及发射的荧光将具有什么特征,以便更好地运用荧光分析技术,把非荧光体变为荧光体,把弱荧光体变为强荧光体。
但由于至今对激发态分子的性质了解不深,还无法对荧光与分子结构之间的关系进行定量描述。
(1)有机物的荧光①共轭效应 具有共轭双键体系的芳环或杂环化合物,其电子共轭程度越大,越容易产生荧光;环越多,发光峰红移程度越大,发光也往往越强。