实验五阳性克隆鉴定和质粒DNA的提取

【仪器与试剂】
（一）、Байду номын сангаас器
恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高 压灭菌锅等。 （二）、试剂

上海生工生物工程技术服务有限公司的 UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒
【实验步骤】

1、将培养好的1～2 ml细菌12,000 rpm离心15秒， 去上清。 2、加100 µl Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮 细菌。 3、加入200 µl Solution II，立即上下颠倒5～10次， 使细菌裂解，室温放置2分钟。 4、加入350 µl Solution III，立即上下颠倒5～10次， 使之充分中和，室温放置2分钟。 5、12,000 rpm离心，5分钟。 6、将步骤5中的上清转移到套放于2.0 ml收集管内 的UNIQ-10柱中，10,000 rpm室温离心15秒。

这样，LacZ基因编码α肽链与失去N端的β 半乳糖苷酶突变体互补，这种互补现象叫α 互补。由α互补而产生的Lac＋细菌易于识别， 因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落， 而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点 后，几乎不可避免地导致产生无α互补能力 的氨基端片段，因此带重组质粒的细菌形 成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简 化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。

碱法提取质粒是基于细菌染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性特征而达到分离目的的。在pH高达 12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双 螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也 断裂，但超螺旋共价闭合环状的质粒DNA两条互 补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲 液调节其pH至中性时，变性的质粒复性迅速而准 确，而细菌染色体DNA的两条互补链彼此已完全 分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠 绕形成网状结构，通过离心，细菌染色体DNA与 不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物以及细 菌碎片等一起沉淀下来而被除去。
实验五 阳性克隆鉴定和质粒DNA提取
【实验目的】


学习大肠杆菌转化阳性克隆的鉴定 学习碱法提取质粒DNA的方法和技术
【实验原理】 重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞后，还需要对转 化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是 最常用是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许 多载体（如pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA 的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ） 的调控序列和β-半乳糖苷酶α肽链氨基端（146个 氨基酸）的编码信息。这个编码区中插入了一个 多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个 氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响 功能。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部 分序列（ω片段）的宿主细胞。虽然宿主和质粒编 码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一 体，形成具有酶学活性的蛋白质 。




7、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一 只收集管中，吸取500 µl Wash Solution到UNIQ10柱，10,000 rpm室温离心30秒。 8、重复步骤7。 9、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一 只收集管中，10,000 rpm室温离心30秒以彻底去 除Wash Solution。 10、将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5 ml 离心管 中，加50 µl DW （或Elution Buffer），室温放 置2分钟后，10,000 rpm室温离心1分钟。离心管 中的溶液即为所抽提的质粒DNA。
【思考题】


1、如何提高大肠杆菌感受态细胞的效率？ 2、如何有效提高CaCl2法转化大肠杆菌的效 率？