柱层 析、薄 层 层 析
薄层层析法
2 展开操作
展开操作是在密闭的容器中进行的,根据薄层板的 大小，选择不同的层析缸，配好展开剂，将展开剂 （一般2-10mL）倒入层析缸，密闭放置一定时间， 待层析缸被展开剂饱和后（目的是防止边缘效应的 产生），再迅速将薄层板放入（注意：切勿使溶剂 浸没样品点，展开剂浸入薄层高度约0.5mm即 可），密闭，展开即开始。当溶剂移动到接近薄板 上端边缘时，取出薄板，画出溶剂前沿。
1、吸附剂
薄层层析最常用的吸附剂有氧化铝和硅胶等， 由于吸附剂的吸附能力有强有弱,吸附力弱的 对化合物的吸附就不甚牢固。这就是吸附层 析能分离不同物质的基本原理之一。
吸附力强弱与吸附剂本身的性质和被吸附的 化合物的性质有关。
吸附剂：吸附剂的选择常是分离工作成败 的关键，对吸附剂的选择与要求和吸附柱层 析相同。要求小于250目,并要求粒度均匀。 用于薄层层析的吸附剂或予制薄层一般活度 不宜过高，以Ⅰ-Ⅲ级为宜，而展开距离则 随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细展开 距离相应缩短。一般不超过10cm。否则可
第八章 色谱分离技术 第四节 薄层层析法
薄层色谱法（Thin-Layer chromatography. 简写 TLC）是一种简便、快速、微量的层析 方法，一般是将某种吸附剂或支持剂均匀地 铺在玻璃板上,形成一个薄层而进行层析的一 种方法。广泛地用于化学成分的分离、精制、 定性鉴定和含量测定。其原理与柱层析基本
选择展开剂的原则是:若被分离的成分亲水性较强时，则 展开剂的极性也应较强。反之，成分亲脂性强，而展开 剂的亲脂性亦应较强。
柱层析和薄层析
柱层析技术柱层析原理:柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。
一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。
当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。
硅胶柱层析流动相：极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来一，定义(chromatography) 柱层析技术又称柱色谱技术。
在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。
将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。
在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。
二，装柱方法装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。
不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm 左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。
接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。
通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。
干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃）8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
薄层色谱和柱色谱分离法
Rf = 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离/溶剂前沿至原点中心的距离
薄层层析可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达５００mg样 品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。
三、 仪器及试剂
硅胶薄板、展开缸、苏丹红乙醇溶液、间硝基苯胺乙醇溶液、苏丹红间硝基苯胺混合溶液、 乙酸乙酯：石油醚（5:95）
薄层色谱和柱色谱分离法
一、 实验目的
１．了解色谱分离的原理及其应用。
2．初步掌握薄层色谱和柱色谱的操作技能。
二、 实验原理
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同， 使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 流动的液体称为流动相，流动相可以是气体，也可以是液体；固定不动的物质称为固定相，可 以是固体也可以是液体（需吸附在支持剂上）。根据组分在固定相中的作用不同，分为吸附色 谱、分配色谱、离子交换色谱等。按操作条件可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱和 液相色谱等。层析缸ຫໍສະໝຸດ 层析板 试样点展开剂
展开版
四、 操作要点和说明
１． 铺板 本实验直接使用购买的薄层硅胶板，每人一块
２． 点样 用毛细管点样，样点距玻璃板１cm，样点直径不超过２mm，三个样点间距５-６mm。
３． 展开 薄层色谱的展开，需要在展开缸中进行如图。展开方式采用倾斜上行法。
４． 计算Rf值 准确地找出原点，溶剂前沿以及三个样品展开后斑点的中心，分别测量溶剂前沿和样点 在薄层板上移动的距离（如图），求出其Ｒf值。
柱色谱是利用各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解析能力不同，使混合物随流动相 流过固定相，发生反复多次的吸附和解析过程，从而使混合物各组分分离开。所用仪器为色谱 柱。纸色谱、气相色谱和液相色谱看教材。
柱层层析法
柱层层析法1. 什么是柱层层析法柱层层析法（Column Chromatography）是一种分离和纯化化合物的常用技术。
它基于化合物在固定相（柱层）和移动相（溶剂）之间的不同亲和性，通过不同程度的分配来实现分离。
2. 柱层层析法的原理柱层层析法的原理基于化合物在柱层中的分配行为。
柱层通常由多孔性固体填充而成，填充物可以是硅胶、氧化铝或其他吸附剂。
移动相则是溶剂，可以是单一溶剂或溶剂混合物。
当样品溶液经过柱层时，不同的化合物会因其与固定相的亲和性不同而以不同速度移动。
较亲和固定相的化合物会被较牢固地吸附在柱层上，而较亲和移动相的化合物则会更快地通过柱层。
这样，化合物就会在柱层中被分离开来。
3. 柱层层析法的步骤柱层层析法通常包括以下步骤：3.1. 准备柱层首先，选择合适的柱层填充物，并将其装填到柱层中。
填充物的选择应根据化合物的性质和需求进行，常用的填充物有硅胶和氧化铝。
3.2. 平衡柱层将柱层与移动相进行平衡，使填充物充分吸附溶剂。
3.3. 样品加载将待分离的化合物样品溶液加载到柱层的顶部。
注意，样品溶液应预先与移动相进行适当的预处理和溶解。
3.4. 洗脱化合物通过逐步改变移动相的组成或使用不同的移动相，将化合物从柱层中洗脱出来。
洗脱时应注意控制溶剂流速和溶剂比例，以保证化合物的有效分离和纯化。
3.5. 收集洗脱液将洗脱液收集起来，通常使用试管或收集瓶。
根据需要，可以将收集的洗脱液进行进一步处理和分析。
4. 柱层层析法的应用柱层层析法广泛应用于化学、生物化学和制药领域。
它可以用于分离和纯化天然产物、合成化合物、蛋白质和核酸等多种化合物。
4.1. 天然产物的提取与纯化柱层层析法可以用于从天然产物中提取和纯化目标化合物。
通过合理选择填充物和移动相，可以实现对复杂混合物中目标化合物的高效分离和纯化。
4.2. 合成化合物的纯化柱层层析法也常用于合成化合物的纯化。
通过柱层层析，可以将化学反应的产物与副产物分离开来，从而获得纯度较高的目标化合物。
薄层色谱与柱层析
叶绿素 叶绿素
叶黄素'， " 叶黄素
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色谱法的分类(fēn lèi)
1)根据流动相分类: 气相色谱—以气体作流动相 液相色谱—以液体作流动相 超临界色谱—流动相是在接近它的临界温度
和压力下工作(gōngzuò)的液体 2)根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定(gùdìng)（液 ）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为 反相分配色谱。当分离脂溶性或极性较小的成分， 如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反 相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用 反相色谱。
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分配柱色谱的应用 分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物
。
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Rf值测量(cèliáng)示意图
Rf与组分性质 (xìngzhì)、流动相 及溶解度有关 极性组分→易保留 ，Rf 小 非极性组分→易流 出, Rf大
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薄层固定相
按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如 硅胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如 C18键合相薄层板）等。
） Rf值＋斑点颜色特征（原位化学反应） 多种展开剂体系展开进行验证 与其他技术联用
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展 开 (z hǎ n kā i) 后 的 薄 层 板
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（二）定 量
目视比较法
将不同量的标准品作为系列，同样样品分 别点在同一薄层上展开，显色后，目测比较斑点颜色的 深浅和面积大小，求出未知物含量的近似值，作为半定 量法，精密度为±10%。
层析分离技术导论
目录
? 柱层析分离的基本概念及其特点 ? 柱层析分离的分类和基本原理 ? 硅胶柱层析的应用
1. 柱层析分离的基本概念 :
? 柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分 混合物中各组分的 物理化学性质的差异 ，使各组
分以不同程度分布在两个相 （固定相和流动相）
中。
? 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物 理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过 多次分配 （吸附 -解吸-再吸附 -再解吸 …… ）以 不同的速率移动 ，从而达到分离的目的。
? V0——凝胶颗粒之间空隙的总体积 （即外水体积） ； ? Vi——凝胶颗粒内部空隙的总体积 （即内水体积） ； ? Vm——凝胶颗粒基质本身所占体积。
? 某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积Ve）为：
Ve=V0+ Kd Vi → Kd=(Ve-V0)/Vi
? Ve——被测分子的保留体积（见层析曲线） ? V0——可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时
柱层析的基本原理
利用待分离物质中各组分与固定相和流动 相的相互作用不同，通过多次相互作用将 不同组分逐渐分离。
柱层析的基本原理
1.吸附层析
? 原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 时，由于固定相对不同物质的 吸附力不同 而使 混合物得到分离。
? 传统吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙 等。
? 在凝胶层析中衍生出 分配常数Kd
1．分配系数
分配系数 K
? 在分配层析中 ，分配系数：类似于溶剂萃
取中的分配系数 K=cs/cm
? cs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度， ? K为分配系数。
? 在一定温度下，当溶质的浓度较低时， K为常数——线性 色谱；
实验六：薄层层析与柱层析
实验六薄层层析及柱层析实验目的1.了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2.掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3.了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4.采用柱层析分离反式偶氮苯及靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别及偶氮基–N=N–两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z）-反（E）-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，及流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过及已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红及偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
柱层析的吸附剂和洗脱剂
氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖 和活性炭等。
3、几种常见吸附剂的特性
（1）氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规 格大多为 100～150 目。
碱性氧化铝（pH9—10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的 样品，这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合、酯和内酯的水解、醇羟基的脱 水、乙酰糖的去乙酰化等不良副反应。所以，这些化合物不宜用有机玻璃柱，实验室常用玻璃柱；径 长比一般为 1:10～1 :20，特例 1:40；内壁光滑均匀，上下粗细一样，管壁无裂缝， 活塞密封良好；根据吸附剂用量（体积）确定柱子的大小，一般吸附剂应填充到 柱子体积的 1/4～1/5 左右。
装柱：有干装法和湿装法两种。 干装法 在下端减压抽气的同时，将吸附剂通过长径漏斗缓缓到入柱内。 湿装法 ①准确加入一定体积的溶剂，然后缓慢加入吸附剂，必要时可轻敲柱壁，排除多 余溶剂，计算主留体积； ②准确量取一定体积的溶剂倒入称量好的吸附剂，间歇性搅拌数次，静置过夜， 次日在搅拌下装柱，计算主留体积。 加样： ①将样品溶于合适的溶剂，在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。最后 在用少量清洁溶剂对主壁洗涤 2～3 次； ②将样品溶于合适的溶剂后，在搅拌下加入样品量 3～5 倍的吸附剂，晾干至粉 末状，然后在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。 洗脱：
5、展开剂的极性规律
单一溶剂的极性大小顺序 石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜ 乙酸乙酯＜乙酸甲酯＜丙酮＜正丙醇＜甲醇＜吡啶＜乙酸 混合溶剂的极性顺序：
苯∶氯仿（1+1）＜ 环己烷∶乙酸乙酯（8+2）＜氯仿∶丙酮（95+5）＜苯∶ 丙酮（9+1）＜苯∶乙酸乙酯（8+2）＜氯仿∶乙醚（9+1）＜苯∶甲醇（95+5） ＜苯∶乙醚（6+4）＜环己烷∶乙酸乙酯（1+1）＜氯仿∶乙醚（8+2）＜氯仿∶ 甲醇（99+1）＜苯∶甲醇（9+1）＜氯仿∶丙酮（85+15）＜苯∶乙醚（4+6）＜ 苯∶乙酸乙酯（1+1）＜氯仿∶甲醇（95+5）＜氯仿∶丙酮（7+3）＜苯∶乙酸 乙酯（3+7）＜苯∶乙醚（1+9）＜乙醚∶甲醇（99+1）＜乙酸乙酯∶甲醇（99+1） →苯∶丙酮（1+1）＜氯仿∶甲醇（9+1）
层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)
几个概念：
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积 、洗脱体积
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对某物质在凝胶柱 内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下 式表示：
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd = －－－－
Vi
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当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完 全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先 洗脱下来；
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迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下，在 相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流 动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
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像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉 ，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂 中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可 分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表 示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯 数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）， 所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。
3
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化 ，大大缩短分析时间。
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5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好 、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂 样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来 ，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在 医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面 也得到了广泛的应用。
柱 层 析、薄 层 层 析
柱色谱、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
采用薄层层析—硅胶柱层析法考察不同展开剂的层析效果
采用薄层层析—硅胶柱层析法考察不同展开剂的层析效果目的研究探讨采用薄层层析-硅胶柱层析法考察不同展开剂的层析效果。
方法以超临界二氧化碳萃取得到的青蒿素粗品作为研究对象，分别采用薄层层析和硅胶柱层析的方法对不同展开剂的层析效果进行研究，选择最合适的展开剂。
结果观察五种展开剂下，青蒿素样品溶液经薄层层析后的结果，可见展开剂为石油醚-乙酸乙酯（80：20）和正己烷-乙醚（80：20）的情况下，溶质的溶解性和选择性都比较好，可以作为柱层析的洗脱剂。
观察两种洗脱剂下的柱层析分离效果，可见选择石油醚-乙酸乙酯（80：20）作为洗脱剂青蒿素的收率以及纯度等均显著高于正己烷-乙醚（80：20）为洗脱剂的情况。
結论在进行中药材的提取纯化过程中，通过薄层层析-硅胶柱层析的方法对不同展开剂的层析效果进行考察，获得最优工艺条件，可以提高其纯化程度。
标签：薄层层析；硅胶柱层析；展开剂；层析效果中草药是我国传统医学的瑰宝，在现代医学的体系下，中草药的有效成分提取、鉴别与纯化是其发展的一个方向。
在其提取过程中常常需要使用层析法来进行初步的鉴定，而随着植化工作的不断深入研究，选择合适的展开剂是对药物的研究发展有重要的意义。
展开剂的选择不恰当，不仅费时，还造成了药物的浪费。
利用薄层层析的方法研究不同展开剂的比移值，是物质鉴定的重要参数[1]。
这个参数的确定不仅与被测物质的极性、固定相吸附剂的吸附能力有关，也与展开剂的极性、洗脱能力等有关[2]，本文以超临界二氧化碳萃取得到的青蒿素粗品作为研究对象，在被测物、固定相吸附剂等都确定的条件下，研究获得青蒿素纯品应选择的最佳展开剂。
具体报告如下。
1资料与方法1.1一般资料实验对象：黄花蒿全草（经自然晒干后做粉碎、筛分处理）、青蒿素对照品（青蒿素的含量可达99.8%）。
试剂：石油醚、乙酸乙酯、乙醚、正己烷、丙酮，均为分析纯。
实验材料和仪器：粗孔柱层析硅胶，粒度在100目～200目之间，为试剂级薄板、低压层析玻璃柱、电子天平、旋转蒸发器。
薄层色谱和柱层析综述
聚酰胺
硅酸镁 多孔玻璃珠
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纤维素硅藻土
离子交换剂 反相键合硅胶（硅烷化处理）
5-薄层板的制备
将吸附剂均匀地涂铺在规定尺寸的玻璃板或其它平面板上， 这一过程称铺板或铺层，即制成薄层板。 板的好坏是分离成功与否的关键，好的板要求吸附剂涂铺 均匀，表面光滑，厚度一致。现有预制板出售。 制板方法主要有干法和湿法两种： （1）干法制板 氧化铝和硅胶可用干法铺板，干法铺层比较简便，制得的 板展开速度快，但展开后不能保存，薄层不牢固，喷显色剂时 易吹散。 方法：将吸附剂均匀地撒在薄层板上，两手用两端圈套的 玻璃棒滚动，厚度0.25～3mm，滚动不宜太快，不能停。 0.25mm左右主要是分析和分离用，3mm的厚板主要是制备色 谱用。
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将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上，装在柱内，并按色 谱法操作，使另一液相流过柱子，分离获得成功。从此出现了 基于分配原理的分配色谱法，因此获得了诺贝尔奖。以后的发 展采用了纤维素、继而采用滤纸作分配色谱载体，发展了纸色 谱法。薄层色谱法的研究和发展也出现在二十世纪的三、四十 年代，现在已和气、液色谱一起成为最常用的色谱分离、分析 方法。为与柱色谱相区别，并突出纸色谱和薄层色谱的特点， 这两种方法也叫平床色谱法（Flat bed chromatography）或平 面色谱法（Planar chromatography）。 色谱法经过多年的发展已有多种操作形式，其分类方法 也有多种。按固定相和流动相的物态可分为以气体为流动相的 气相色谱（包括气固色谱、气液色谱）和以液体为流动相的液 相色谱（包括液固色谱、液-液色谱）；如以固定相的操作方 式以及形状分类则有柱色谱、 纸色谱、薄层色谱；
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薄层色谱中，Rf值与组分的分配系数K值有关：
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S ‘)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S‘)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
TLC(薄层层析色谱)技术原理与应用
精心整理TLC（薄层层析色谱）技术原理与应用一、薄层层析（TLC）简介薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。
把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。
由于层析在薄层上进行故而得名。
薄层层析是一种微量、快速的层析方法。
它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。
还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。
根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶；用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。
吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。
（较多用）TLC→分配TLC→固定相为液态（通常为水）→固定相吸附在支持剂上。
（一）吸附薄层的基本原理：吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。
吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。
吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。
1.吸附薄层层析：在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。
在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸，……。
由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。
展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离。
中药中的有效成分复杂多样，结构近似者不少。
特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。
只有先设计出可用的层析条件，再经摸索改进，才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。
然后才能谈得上进一步的分析研究。
要设计出合理有效的层析条件，必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领。
下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍。
层析的名词解释
层析的名词解释层析（chromatography）是“色层分析”的简称。
利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。
有吸附层析、分配层析两种。
一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。
层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。
层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
语源学chroma意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。
色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
层析（色谱）chromatography在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。
用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。
将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均匀的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography），后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析，即在固定相的一端，点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入，移动接近另一端。
通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。
当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。
也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直），使各成分分离完全的双向层析（two-dimensional chromatography）。
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实验名称:柱层 析、薄 层 层 析
一、实验目的
1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理
色谱法（Chromatography ）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:
1、分离混合物 一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物 有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移 动距离，称比移值（Rf 值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
距离溶剂前沿至原点中心的点中心的距离
溶质最高浓度中心至原
f R
4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱
分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。
当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。
当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来
薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
二、基本操作训练：（含仪器装置和主要流程图）
正确装柱、制板、点样及分离操作
（1）（2）（3）
柱层析薄层板在不同的层析缸中展开的方式
【操作步骤】
薄层色谱
1、薄层板的制备（湿板的制备）
薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。
薄层应尽量均匀且厚度要固定。
否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。
在烧杯中放入2g硅胶，加入5—6ml蒸馏水，调成糊状。
将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。
也可买市售的硅胶板切割成适宜大小备用。
本实验用此法制备薄层板5片：吸附剂为硅胶G，用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液调成浆料。
2、点样
先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
若在同一板上点几个样，样点间距离应为1。
点样要轻，不可刺破薄层。
3、展开
薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。
为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。
在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。
将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。
盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。
晾干，观察斑点位置，计算Rf值。
4、显色
凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱。
薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。
对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸锌、荧光黄）的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈有色斑点。
也可用卤素斑点试验法来使薄层色谱斑点显色。
本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。
柱色谱
1、装柱（湿法）
用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部，轻轻塞紧，关闭活塞，向柱中倒入溶剂至约为柱高的3/4处，通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入色谱柱用中性氧化铝，打开活塞，控制流出速度为1滴/秒；并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部，使填装紧密，当装柱至3/4时，再在上面加一片小圆滤纸或脱脂棉。
操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于氧化铝的上层。
2、上样
当溶剂液面刚好流至滤纸面时，立即沿柱壁加入待分离样品溶液，当此溶液流至接近滤纸面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，如此连续2—3次，直至洗净为止。
3、洗脱
用已配好的溶剂（学生自己配制）洗脱，控制流出速度。
整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。
极性小的色带首先向下移动，极性较大的留在柱的上端，形成不同的色带。
观察色带的出现，并用锥形瓶收集洗脱液。
三、实验关键及注意事项：
1、薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。
2、点样时，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm，
3、柱层析时，柱子要致密紧实，无气泡。
四、主要试剂及产品的物理常数：（文献值）
五、提问纲要
1、为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？
2、柱子中若有气泡或装填不均匀，将给分离造成什么样的结果？如何避免？
3、如何利用R f值来鉴定化合物？
六、主要试剂用量、规格
1%偶氮苯、1%间硝基苯胺、荧光黄(95%乙醇, 1mg/1ml)、次甲基蓝、环己烷:乙酸9:1
七、时间分配及控制
计划安排４h。