一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立_陈晓

lacZ-pShut tle 质粒 DNA 5μL , 充分混 匀 。 用未加入质 粒 DNA 的溶液作为阴性 。 在剧烈吹泡吹打下 , 逐滴加 入 500μL 2 ×HBSP 溶液 , 室温静置 30min 。 将细胞用 无血清培养基洗 2 遍 , 迅速加入 DNA-CaPi 复合物盖住 表 面 , 37 ℃放 置 30min , 加 入 1mL 含 10 % FCS 的 DMEM 培养基 。 37 ℃ 5 %CO2 下培养适 当时间后 , 弃 上清 , 加入预热的含 10 %FCS 的 DM EM 培养基 5mL , 37 ℃ 5 %CO 2 下培养 48h 。 用 X-g al 染色法[ 7] 检测 β-半 乳糖苷酶的表达 , 用 1 ×PBS 缓冲液冲洗 2 遍 , 室温下 0 .5 %戊二醛固定 细胞 15min , 1 ×PBS 缓 冲液冲洗 3 遍 , 用 X-gal 染液染色 , 37 ℃放置 24h 。 洗去染液 , 光学 显微镜下观察蓝染细胞 。 1 .2 .2 优化磷酸钙转染条件 1 .2 .2 .1 pH 值和 质粒纯度 的影响 HBSP 缓 冲液的 pH 值分别调至 6 .70 , 6 .96 , 7 .10 , 转染 HEK 293T 细 胞 , 37 ℃ 5 %CO2 下培养 48h 后 X-gal 染 色 , 光学显微 镜下观 察细胞 ;分别用 纯化和 未纯化 的 lacZ-pShutt le 质粒转染 HEK 293T 细胞 , 37 ℃ 5 %CO2 下培养 48h 后 X-g al 染色 , 光学显微镜下观察细胞 。 1 .2 .2 .2 转染后培养时间的优化 细胞转染后分别培
将 DNA 导入动物细胞中的方法很多 , 磷酸钙转染 法经济简单而且对细胞无毒性 , 是目前做真核细胞转 染最常用的方法之一 。磷酸钙转染法是 G raham 等[ 1] 人于 1973 年建立的 , 利用细胞的内吞作用将磷酸钙D NA 复合物导入细胞内部[ 2-3] , 此后该法 作为常规方 法用于多种细胞的基因转染 , 可获得短暂或长期表达 。 但是随着该技术的广泛应用 , 人们发现在磷酸钙转染 法中 , 影响转染成功与否及转染效率的高低的因素较 多 , 经常造成转染的低效率和不稳定性 , 国外探讨过一 系列影响磷酸钙转染的条件[ 4-6] , 但目前国内对磷酸钙 转染条件进行系统研究的文献较少 , 本文基于此目的 , 通过对磷酸钙转染条件的优化 , 确定了几个对转染效 率至关重要的因素 , 将 lacZ-pShut tle 质粒高效率 地导 入 HEK 293T 细胞 , 比以往文献报道的转染效率提高 了约 103 ～ 105 倍 。
实验结果表明 , 转染后培养 6h 后进行甘油休 克 , 甘油休克时间为 4 .5min 时转染效果最佳 , 均极大提高 了转染效率 。这可能与细胞对沉淀物和甘油的耐受性 有关 。培 养时间越 长 , 沉 淀物析出 越多 , 细胞越易 死 亡 ;甘油与细胞作用时间短 , 摄入沉淀物少 , 作用时间 长 , 则对细胞有毒性 。
5 %CO2 下培养 48h 后染色 。 洗去染液 , 光学显微镜下 观察蓝染细胞 , 同上述方法计算转染效率 。
2 结果
2 .1 lacZ-pShutt le 质粒的转染及 X-gal 染色 阴性对 照没有蓝染细 胞 , 而 lacZ-pShut tle 质粒用
磷酸钙法转染细胞有明显的蓝染细胞 , 并且是全细胞 蓝染(图 1)。
油休克 。结果表明 , 转染后培养 6h 进行甘油休克效果
最佳 , 比培养 0h 直接进行休克转染效率升高584 .4 %(表 1 , 图 3)。
4期
培养时间 / h Cultured time
0 2 4 6 8 10 12
陈 晓 , 等 :一种用磷酸钙法高效转染 HEK 293T 细胞方法的建立
图 1 转染后染色 细胞 Fig .1 Dying cells after transfectio n
2 .2 pH 值和质粒纯度对转染率的影响 HBSP 缓冲 液的 pH 值 在 6 .70 和 7 .10 时 转 染
H EK 293T 细胞的效果不好 , 细胞成活率低 , 有大颗粒 状物体存在(图 2 A , B);pH 值在 6 .96 时转染效果好 ,
佳 ,比不用甘油休克转染效率升高 130 .8 %(表 2 ,图 4)。
休克时间 / min S hock
0 1 .5 3 .0 4 .5 6 .0 7 .5 9 .0
表 2 休克时间对转染效率的影响 T able 2 T he affectio n of gly cerol shock time to the efficiency of transfection
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x ±s
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11 12 21 16 22 21 25 15 16 26
21 15 20 18 24 24 28 19 19 20
29 32 31 32 41 31 26 27 28 30
23 21 24 23 32 26 27 21 24 21
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22 15 24 25 24 20 23 21 18 27
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9 12 11 14 11 13 11 14 12 13
(1 .中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室 , 山东省海洋药物重点实验室 , 海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003 ;2 .青岛大学医学部 附属医院呼吸内科 , 山东 青岛 266003)
摘 要 : 利用磷酸钙转染法将 lacZ-pShuttle 质粒导入 HEK 293T 细胞中 , 实验证明 , pH 值 、DNA 纯度 、转 染后培养时间和甘 油休克时 间是影响转染效率的重要因 素 。 转染 后培养 6h 进行 甘油 休克 效果最 佳 , 比培 养 0h 直 接进行 休克 转染效 率升 高 584 .4 %;甘油休克时间为 4.5min 时转染效果最佳 , 比不用甘油休克转染效率升高 130 .8 %。 通过对 影响转染 的几个条件 进 行优化 , 建立了 1 种可以高效转染 HEK 293T 细胞的方法 , 且简便易行 。 关键词 : 磷酸钙转染 ;甘油休克 ;X-g al 染色 中图法分类号 : Q 813.4 文献标识码 : A 文章编号 : 1672-5174(2005)05-807-05
基金项目 :山东省自然科学基金项目(Y 2000C 09)资助 收稿日期 :2004-02-03 ;修订日期 :2004-04-28 作者简介 :陈 晓(1978-), 女 , 硕士 。 E-mai l :yuw g66 @ouc.edu .cn 联系人 :Tel :(0532)82031680 , Fax :(0532)82033054
第 35 卷 第 5 期 2005 年 9 月
中国海洋大学学报
PE RIO D ICA L O F O CEAN U N IV ERSIT Y O F CHIN A
35(5):807 ～ 810 Sept ., 2005
一种用磷酸钙法高效转染 HEK 293T 细胞方法的建立
陈 晓1 , 蒋捍东2 , 路新枝1 , 于文功1
细胞存活率高 , 蓝染细胞明 显(图 1B)。 同样 , 未纯化 的 lacZ-pShut tle 质 粒转 染 HEK 293T 细胞 转染 效率 低 , 细胞成活率很低(图 2C), 而 纯化后的质粒转染效 率高 , 蓝染细胞明显 。
2 .3 转染后培养时间对转染率的影响 细胞转染后分别培养 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 12h , 再进行甘
8 .9 1 .2 1 .4 2 .0 1 .6 1 .1 6 .5
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3 讨论
HBSP 缓冲液的 pH 值调至 6 .96 是本实验成功的 关键之一 , pH 值偏酸导致细胞成活率偏低 , pH 值偏碱 将导致有大颗粒状物体存在 , 细胞成活率急剧下降 , 推 测是因为 pH 值影响了磷酸钙沉淀形成时的形态 , 与转 染过程中磷酸钙的成 型密切相关[ 9] 。 同时质粒 DN A 溶液不能存放过久或含杂蛋白及 RNA , 否则将导致转 染失败 , 最好在临转染前纯化 DNA 。
12 17 21 14 19 13 25 15 17 16
7 14 8 11 7
6
9 13 11 11
13 .3 ±0.2 18 .5 ±0.2 20 .8 ±0.3 30 .7 ±0.3 24 .2 ±0.2 16 .9 ±0.2 9 .7 ±0.1
转染率 T ransfection efficiency/ ×10 -3
Fra Baidu bibliotek
油 ;X-gal 染液临用前加入终浓度为 1mg/ m L 的 X-gal (Sig ma);0 .5 %戊二醛 ;玻璃奶(Pharmacia)。 1 .2 方法 1 .2 .1 lacZ-pShuttle 质 粒 用磷 酸钙 转染 法转 染 HEK 293T 细胞 在 60m m 细胞培养皿中培养 HEK 293T 细胞至密 度为 50 %, 转染前 3h 换 液 。 在 10mL 离心 管中依次加入 :ddH2O 445μL , 2 .5mol/ L CaCl2 50μL ,
1 材料和方法
1 .1 材料 1 .1 .1 细胞株与质粒 HEK 293T 细胞株由人肾上 皮细胞系 293 细胞派生 , 由本室提供 。
pShut tle 质粒 购自 C LONT ECH , lacZ-pShutt le 质 粒由本室构建 , 将全长 3 .5kb 的 lacZ 基因以 Xba I 和 Not I 酶切位点插入 MCS 位点 , 位于 Pcm v 启动子下 游 。 临转染前用玻璃奶纯化质粒 DNA 。 1 .1 .2 试剂 2 ×HBSP 缓冲液 , 精确调节 pH 值 ;高 糖 DMEM 培养基(Gbicol BRL);新生小牛血清(F CS , 杭州四季星);2 .5mol/ L CaCl2 ;1 ×PBS 缓冲液 ;15 %甘
3 .2 ±0.1 8 .6 ±0.1 18 .2 ±0.2 21 .9 ±0.3 12 .5 ±0.2 11 .4 ±0.2 12 .0 ±0.2
转染率 T ransfection efficiency/ ×10 -3
2 .1 5 .7 1 .2 1 .5 8 .3 7 .6 8 .0
2 .4 休克时间对转染率的影响 由结果可见 , 甘油休克时间为 4 .5min 时转染效果最
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表 1 转染后培养时间对转 染效率的影响 Table 1 T he affection of cultured time after transfection to the efficiency of transfection
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养 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 12h , 用 15 %甘油休克 4 .5min , 弃上 清 , 加入 预热的 含 10 %FCS 的 DM EM 培养 基 5m L , 37 ℃5 %CO2 下培养 48h 后染色 。 洗去染液 , 光学显微 镜下观察蓝染细胞 , 随机选取 10 个视野 , 观察蓝染细 胞 , 计数(个), 按平均每视野 1 500 个细胞 , 根据染色细 胞与总细胞的相对数目计算转染效率[ 8] 。 1 .2 .2 .3 休克 时间的 优化 细 胞转染 后培养 6h , 用 15 %甘油分别休克 0 , 1 .5 , 3 , 4 .5 , 6 , 7 .5 , 9min , 弃上清 , 加入预热的含 10 %F CS 的 DM EM 培养基 5mL , 37 ℃