基因工程的主要技术原理

=
4.61×
G f
N=
4.61×
G f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片断的平均长度如果是1.7×104 bp
N=
4.61×
G f
=
4.61×
3×109 1.7×104
= 8.1×105
二、 cDNA文库的构建
1. cDNA
以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
2、Northern blot
原理和方法: 是相对于Southern blot而命名的。 利用 DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理， 通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
单链RNA
变性胶电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH或高温变性
标记的探针
应用: 主要用于基因在转录水平上的表达研究。 ➢基因时空特异性表达，及表达模式分析； ➢候选基因表达分析，有利于排除候选 基因，等…
BAC:
容量为 300 kb
3. 基因文库构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
① 物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法：
内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
用的探针是抗体(蛋白质)
第五节 基因文库构建
一、基因文库的构建 1. 基因文库（gene library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生 物体的全部基因，称为基因文库。
2. 构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构 建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
② 降解mRNA模板
用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA 杂交分子中的mRNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶 3’
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
③ cDNA第二链合成
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯 回来的双链发卡结构（机理不明），可成 为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚 合酶合成第二链DNA.。
4. 构建cDNA文库的一般步骤
（1）总RNA（total RNA）提取
提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化
① 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴， 将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA 等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。
② mRNA的分离纯化
Column（柱）
分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
（3）cDNA的合成
① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。
用Oligo dT（或随机引物）作引物，合 成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA
mRNA
5’
5’TTTTTTT cDNA 反转录酶
Oligo dT引物
5’
cDNA第一链
cDNA第二链合成
DNA聚合酶
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
④去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会 导致cDNA中有用的序列被切掉！）。
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
核酸酶S1
5’
cDNA第一链
3’
3’
cDNA第二链
5’
妙用RNaseH
这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的 mRNA，并将其降解成许多小片断。
碱变性会导致RNA的降解. (3)探针不同.
3、 Western blot
通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检 测蛋白质样品。 主要用于基因在蛋白质水平上的表达研 究。
Western blot的原理与Southern blot相比 有两点不同:
(1) 检测的对象不同. (2) 探针的性质不同,在Western blot中使
第二章 基因工程的主要技术原理
五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自ຫໍສະໝຸດ Baidu影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因文库筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头 ③ 同聚物加尾
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
粘性末端
4. 基因组文库的大小
一个文库要包含99%的基因组DNA时所 需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln (1-f)
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）
f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数
N：所需的重组载体数（克隆数）
N=
ln (1-p) ln (1-f)
=
ln (1-99%) ln (1-f)
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进 行保存和扩增，称cDNA文库。
3. cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。
物理图谱
CRG2(2)
CRG3(0)
CRG4(0)
RM5647(5)
5.8 kb
4.8 kb
6.4 kb
ab
Pi36-1
Pi36-2
c
RiceGAAS预测
NBS-LRR
NBS-LRR
Northern blot的原理与Southern blot相比 有三点不同:
(1)检测的对象不同. (2) 变性方法是不同的, 它不能用碱变性,因为