手把手教你PCR引物设计来自小木虫
PCR引物设计详细步骤
PCR引物设计详细步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于放大DNA片段。
在PCR过程中，引物的选择非常重要，因为引物的设计质量直接影响到PCR反应的效率和准确性。
本文将详细介绍PCR引物设计的步骤。
步骤1. 确定目标序列首先，需要确定所要放大的目标序列。
这可以是任何你感兴趣的DNA片段，如某个基因的编码区域，特定的DNA序列等。
2. 提取目标序列从已有的DNA样本中提取目标序列。
可以通过DNA提取试剂盒等方法进行提取，确保获得纯净的DNA。
3. 序列比对使用BLAST等工具将目标序列与已知的序列数据库进行比对，以确认目标序列的唯一性和可能存在的变异。
4. 引物设计原则根据目标序列，设计符合以下原则的引物：•引物长度通常在18-25个碱基对之间。
•碱基组成均匀，避免引物中存在大量的G或C碱基，以及连续多个重复的碱基。
•引物之间的互补性尽量避免，以防止二聚体的形成。
•避免引物末端存在碱基的互补序列，以防止非特异性扩增。
5. 引物设计工具使用引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等，在目标序列中选择合适的引物。
这些工具可以根据给定的参数，自动设计合适的引物。
6. 引物评估对设计的引物进行评估，包括检查引物的反向互补性、引物的Tm值（熔解温度）、引物的二聚体和自身结构等。
确保引物的质量达到实验要求。
7. 引物合成将设计好的引物发送给合成公司进行合成。
确保引物的纯度和浓度符合要求。
8. PCR反应使用合成的引物进行PCR反应，按照标准的PCR反应体系和条件进行。
根据实验需求调整PCR反应的温度、时间等参数。
9. PCR产物验证通过凝胶电泳等方法验证PCR反应产物的大小和纯度。
确保PCR反应成功，并且没有非特异扩增的产物。
结论PCR引物设计是PCR反应成功的关键。
通过遵循引物设计的原则，结合引物设计工具的辅助，可以设计出合适的引物，弥补PCR技术在DNA放大中的巨大优势，为实验研究提供有效的工具。
PCR引物如何设计
PCR引物如何设计“小胡，老板让我跑一下PCR，具体我要订什么呀？”“引物订了吗？”“没有呀，怎么订？”说起Real-Time PCR，大家都不陌生，毕竟是检测基因转录水平表达情况最基本的实验了。
但是对于没有接触过的小伙伴来说，还是挺陌生的，所需试剂仪器就先不聊了，今天小编单就lncRNA/mRNA 引物设计来说道说道。
拿到一个指标，我们首先通过NCBI的gene查询有几个转录本。
只有一个转录本的话，一切好说，直接拿序列。
若存在多个转录本，而要检测的是目的指标的总的转录表达水平（不考虑剪接变异体）时，一般会取该指标的所有转录本的公共序列进行设计引物（如果没有公共序列，则针对表达量最丰富的转录本进行设计）。
当我们想检测一个指标的不同转录本的表达情况时，这就要单独对转录本的特有部分进行设计了。
说了这么多，那引物到底怎么设计的呀？总的来说，我们一般主要从4方面获取，文献查询，PrimerBank，自己设计，外包公司设计。
1. 文献查询我们把自己的指标输入pubmed，然后着重看文章的材料方法部分。
如果该文章进行了real time PCR实验的话，那么在材料方法区域会单独作为实验的一个分支标注出来（如下图）。
有的会提示引物序列具体见附表，有的则直接在材料方法给出，这样就可以轻松得到引物序列啦。
注：Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR），两者表达意思一致。
当然，文献可供选择的引物有很多，但是尽量选择高分文献，毕竟可信度较高，IF不是说说而已的。
2. PrimerBank如其名，这是一个储存引物的数据库（/primerbank/），目前提供人和鼠两个物种。
具体操作很简单，这里输入基因官方名称后提交。
结果会显示具体针对哪个转录本设计，引物长度，扩增产物长度，具体位置等。
但是缺点是不能看到参考文献，所以无从知道引物来自几分文献，所以拿到引物后尽量评价后再进行使用。
如何根据要求自己设计PCR引物
如何根据要求自己设计PCR引物1PCR引物设计课堂笔记○PCR这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？今天我就来给大家用实例演示一下哈。
首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物设计是PCR的关键，附上PCR的基本流程图：○引物设计的原则：1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。
退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高；引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物：2用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1○简单点说，就是现在我们要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点，也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段，这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid 1中，然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的，示意图见下。
PCR引物设计
PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR引物的设计对PCR反应的成功与否至关重要。
下面将详细介绍PCR引物的设计过程。
第一步，选择目标序列。
在设计PCR引物之前，首先需要确定要扩增的目标序列。
目标序列可以来自已知基因的特定片段，也可以通过测序等方法获得。
第二步，引物长度和温度。
PCR引物通常为单链DNA片段，一般长度在18-30个碱基对之间。
引物长度过短容易引起非特异性扩增，引物长度过长则会导致特异性降低。
此外，引物的长度还会影响PCR反应的温度。
一般情况下，引物的长度越长，PCR反应的温度就需要越高。
通常，引物的长度最好在20-24个碱基对之间。
第三步，引物序列的选择。
为了确保PCR反应的特异性，引物的选择至关重要。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基序列，以确保引物能够精确结合到目标序列上。
此外，引物的序列还应避免序列内部的反向重复和结合位点之间的重复序列。
第四步，引物的熔解温度（Tm）的确定。
引物的熔解温度是引物与模板DNA结合的温度。
引物的熔解温度应该尽量接近反应的最低温度，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
引物的Tm可以通过以下公式计算：Tm = 69.3 + 0.41 * (G+C%) - 650/length其中G+C%表示引物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分含量，length表示引物的长度。
第五步，特异性分析。
在设计引物之前，可以通过生物信息学工具对引物进行特异性分析。
特异性分析可以通过引物序列与目标序列的比对来进行。
引物在目标序列上应有唯一的结合位点，并且不应该与其他非目标序列有任何重复的位点。
第六步，引物的杂交性能。
为了确保引物的杂交性能，引物应具有适当的糖尖端修饰和杂交性能。
糖尖端修饰可以增强引物的杂交性能，并减少非特异性结合。
此外，引物的GC含量应该适中，过高或过低都可能导致非特异性结合的问题。
第七步，引物的交叉反应。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
如何设计PCR扩增引物
如何设计PCR扩增引物1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采⽤primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度⼀般为15-30 bp，常⽤的是18-27 bp，但不应⼤于38，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应[2]。
● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较⼤的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显⾼于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使⽤碱基A[3][4]。
另外，引物⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物[2]。
● 4. 引物序列的GC含量⼀般为40-60%，过⾼或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太⼤[2][5]。
● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的⾃由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选⽤3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼的引物。
引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
●7. 引物⼆聚体及发夹结构的能值过⾼（超过4.5kcal/mol）易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏[8]。
●8. 对引物的修饰⼀般是在5’端增加酶切位点，应根据下⼀步实验中要插⼊PCR产物的载体的相应序列⽽确定。
PCR 引物设计及软件使用技巧
PCR 引物设计及软件使用技巧自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。
使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。
可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
一般来说，专门进行PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。
本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。
(1)引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导错配。
PCR引物设计
Template DNA
5′ ′ 5′ ′
5′ ′
Primer 1 5′ Primer 2 ′
Cycle 1
5′ ′ 5′ ′ 5′ ′ 5′ ′
Cycle 2
5′ ′ 5′ ′ 5′ ′ 5′ ′ 5′ ′ 5′ ′ 5′ ′ 5′ ′
5 Essential Components of PCR Reaction
⑥引物3'端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响.末位碱 基为A 的错配率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3'端 使用碱基A.5'端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点 或标记物. ⑦选择 GC 含量为40%到60%或GC 含量与模板GC 含量接近的引物.引 物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, ).设计 5'端和中间 区为G 或C 的引物,这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的 稳定性.过高或过低都不利于引发反应. ⑧两引物的Tm 值相差不应大于5℃ . DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度.不同序列的 DNA,Tm值不同.DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系. 复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度 可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性. 复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合. ⑨对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插 入PCR 产物的载体的相应序列而确定.
猪的UCP3基因(脂调节基因)的第五外显子(exon) 猪的UCP3基因(脂调节基因)的第五外显子(exon) 序列 1.输入目的基因序列 1.输入目的基因序列 2.选中primer图标,点S图标.开始设计正义链. 2.选中primer图标,点S 3. edit primer,在引物的5端加入选好的酶切位点并在 primer,在引物的5 其左侧加3个保护碱基TTA ,完成后点analyze, 其左侧加3个保护碱基TTA ,完成后点analyze, 认为可以后点OK. 认为可以后点OK. 4.设计反义链引物. 4.设计反义链引物. 5.显示满足设计参数的候选结果. 5.显示满足设计参数的候选结果. 6.Rating表示引物评分,优选评分高的. 6.Rating表示引物评分,优选评分高的.
实验三 PCR引物设计
实验三、PCR引物设计一、实验目的学习和掌握PCR特异引物设计的原则与要求，并利用引物设计软件（网络引物设计软件/，/）设计特异引物。
寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个PCR扩增反应成功的关键。
所选的引物序列将决定PCR产物的大小、扩增位置、以及扩增区域的Tm值等重要的物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RT-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。
一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，均易于在计算机软件中被编码和限定。
计算机的高速度运算可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物变换的可能性的大量计算。
通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。
因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5’端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增产物时发挥作用。
二、基本PCR引物设计原理与参数要求引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增产物，在EB 染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
PCR中如何设计引物
PCR中如何设计引物引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA片段。
设计合适的引物是PCR反应成功的关键。
本文将介绍PCR中如何设计引物的一般原则和方法。
引物设计的原则引物设计应遵循以下原则：1.引物长度：引物长度通常在18到30个碱基对之间，较短的引物可能导致非特异性扩增，而较长的引物则可能增加非特异性结合的风险。
2.Tm值：引物的熔解温度（Tm值）应该相似，通常要在50°C到65°C之间。
这样能够确保引物在PCR反应的温度范围内稳定结合到DNA模板上。
3.特异性：引物应与目标DNA序列保持高度特异性的碱基互补配对，以避免非特异性扩增。
可以使用序列比对软件来确保引物的特异性。
4.无自身互补和剩余互补：引物自身及与它们自身或其他引物的互补序列不应该存在，避免引物形成二聚体或非特异性扩增的可能性。
5.区段选择：引物的选择应基于目标DNA序列上的特定区段，通常位于基因的保守区域或功能位点上。
引物设计的步骤以下是PCR引物设计的一般步骤：步骤一：目标序列分析对于需要扩增的目标DNA序列，首先进行详细的分析。
包括确定目标DNA序列的起始和终止位置，以及预测目标DNA序列的理论大小。
步骤二：引物设计软件的选择选择一种引物设计软件，常见的有Primer3、Primer-BLAST等。
这些软件可以根据一些参数，如Tm值、引物长度等，自动生成一组可能的引物序列。
步骤三：引物选择与比对使用引物设计软件生成的引物序列，根据上述引物设计的原则，选择一组最佳的引物。
然后，使用引物设计软件进行序列比对，确保引物的特异性。
步骤四：引物合成购买选定的引物序列，并选择可靠的引物合成商进行合成。
结论合理设计的引物对PCR反应的成功非常重要。
在PCR中设计引物时，需要考虑引物长度、Tm值、特异性、互补性等原则，并通过引物设计软件进行分析和比对，最终选择最佳的引物序列。
这样可以确保PCR反应的特异性和可靠性。
手把手教你设计引物（图文并茂）
手把手教你设计引物（图文并茂）不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。
没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。
引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。
这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。
就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。
如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。
以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站/index.html1. 输入目的基因，进入2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS6. 然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断下载后打开的WORD7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。
选取并复制第6和第7外显子序列8. 登陆/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到。
引物设计不求人！手把手教你设计RT-qPCR引物！
引物设计不求⼈！⼿把⼿教你设计RT-qPCR引物！RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应，是⼀种在DNA扩增反应中，以萤光染⾊剂检测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的⽅法。
OK～这⾥对RT-qPCR的原理，应⽤及数据分析就不再赘述了，因为今天我们主要讲的是如何设计出好的PCR引物。
相信科研⼩伙伴们都已经⽤过Pubmed来设计引物了，基本就是 “傻⽠式操作”就解决了！但这⾥还需提醒⼩伙伴们两点：1. 需跨越⾄少⼀个外显⼦连接（⼀般我们⽤来做RT的RNA都是通过Trizol抽提法分离出来的，为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来，就要⾄少跨越⾄少⼀个exon-exon junction 了）。
2. 不要忘记选对“物种”！（这⾥以⼈种⽰例）但是Pubmed设计出来的引物⼀般不尽如⼈意，⽐如说引物之间存在极⼤的互补性，3’端的互补重叠，形成引物⼆聚体等等。
因为⽤Pubmed设计引物本⾝能设置的参数条件就很少，所以它才是最简单的。
所以，今天我要给⼤家介绍两款实⽤的软件，Primer Premier 6.0 和 Oligo 7.0。
今天主要讲讲第⼀款，⾄于第⼆款，改天再聊啦！当然，这两款软件，要想⽤全功能版本，都是需要付费的哦！不过...，我们伟⼤的祖国有强⼤的某宝，这⾥就不多说了哈。
好了，我们进⼊今天的正题……（说了这么多废话，终于要进⼊正题了！！！）⾸先，我们选⼀个基因举例来说，PPARA，⾄于为什么会选这个基因呢？因为啊，PPAR⽬前是肿瘤学研究中的⼀个“明星基因”，它的全称是Peroxisome proliferator-activated receptor, 即过氧化物酶体增殖物激活型受体，⽬前发现有三种亚型，PPAR a，PPARbeta/delta，PPAR r。
好吧…….听着好复杂的样⼦啊！总之，管它到底是什么呢，下⾯来说说它的引物如何设计。
PCR引物设计方法和原理
实验试错法是一种相对原始的引物设计方法，通过实验尝试和调整来找到最佳的引物序列。该方法适用于实验条 件不明确或缺乏先验知识的情况，通过反复实验和调整来获得最佳的引物组合。虽然实验试错法效率较低，但对 于探索新领域和未知情况具有一定的价值。
04 pcr引物设计的原理
引物的特异性原理
引物的特异性原理是指引物与模板DNA的结合具有严格的特 异性和专一性。在PCR扩增过程中，引物与模板DNA的结合 位点是特定的，只有当引物的序列与模板DNA完全互补时， 引物才能与模板结合，进行有效的扩增。
为确保引物的特异性，通常要求引物在3'端具有18-20个与模 板DNA互补的序列，以形成稳定的氢键，同时要求引物之间 不存在互补性，以避免形成引物二聚体。
引物的长度和浓度原理
引物的长度和浓度是影响PCR扩增的重要因素。引物的长 度通常在18-30个核苷酸之间，过短可能无法有效结合模 板，过长则可能导致结合不稳定。
引物的浓度也需进行优化，过高可能导致非特异性结合，过 低则可能影响扩增效率。根据经验，一般将引物浓度设定在 0.1-0.5μM之间，具体浓度根据引物的长度和序列特性进行 适当调整。
引物的温度和平衡原理
引物的温度和平衡原理是指在PCR扩增过程中，需要选择合适的温度使引物与模板DNA结合，并保持引物与模板之间的平衡 状态。
详细描述
计算机辅助设计法利用专业的引物设计软件，根据输入的目标序列和实验条件，自动筛 选出符合要求的引物序列。该方法能够大大提高引物设计的效率和准确性，减少人工误
差和实验时间。常用的引物设计软件包括Primer3、Oligo等。
实验试错法
总结词
通过实验尝试和调整来找到最佳引物的方法，适用于未知情况和新领域。
PCR引物流程设计详解
PCR引物设计流程详解本文目的：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即IL-4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens）2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式，并将序列保存到文档二、使用primer premier 5.0设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况（上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中三、使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收4、同理，录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物GC%8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、分析PCR整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入NCBI主页，并选择blast2、选择primer blast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击getprimer进行对比4、查看blast结果Blast 结果显示，尽管IL-4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。
qPCRprimerdesign（手把手教你设计qPCR引物）
qPCRprimerdesign（手把手教你设计qPCR引物）Step-by-Step Guide to Designing qPCR PrimersBy Marisa Fernández-Cachón - 6th February, 2013 Primer design is a very important step while setting up your qPCR assay. If your primers anneal poorly or to more than one sequence, this can significantly impact the quality and reliability of your results. The good news is that primers are cheap, so you can test several different pairs and choose the best pair to use in your experiments. The bad news is that primer testing requires time and patience, so the sooner you get a pair of primers working, the better. I like to use the NCBI tool Primer BLAST to design primers for qPCR. Here are the main steps to design primers using this free program: Go to the Pubmed gene database and search for your gene of interest. You can filter by species in the right corner of the screen. Click on the gene of interest and scroll down until you find the NCBI Reference Sequence (RefSeq) of your gene (e.g. “NM_203483”).Click there and in the next screen you can see on the right corner of the screen a link to “Pick primers”.Primer ParametersPCR product/amplicon size: For efficient amplification in real-time RT-PCR, primers should be designed so that the size of the amplicon is <200 bp.Number of primers to return: Up to you, but 10 won’t take too long to calculate and will give you plenty of options to choose from.Melting temperature: as a rule, aim for a minimum of 57°C and a maximum of 63°C; the ideal melting temperature is 60°C (with a maximum difference of 3°C in the Tm’s of the twoprimers).Exon/intron selectionTo avoid amplification of contaminating genomic DNA, design primers or probes so that one half hybridizes to the 3′ end of one exon and the other half to the 5′ end of the adjacent exon. To do this, simply select “Primer must span an exon-exon junction”. You don’t ne ed to change the other settings.Primer pair specificity checking parameters: Leave the default settings. The program will use then the Refseq mRNA sequence from the organism that you selected in the screen before to calculate the primers.Checking the output screenThe primers should end with a C or G residue, because T and A residues can bind more easily to DNA in a non-specific way.Optimal primers also have a GC content of around 50-60% to ensure maximum product stability.Regarding self complementarity, the lower the better, to decrease the possibility of primer-dimer formation. Ideally the primer will have a near random mix of nucleotides.Now you can pick the best two or three primers and test them. Good luck!。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，避免与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应避免高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）避免二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应避免引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）避免引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应避免以上情况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要考虑，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以方便后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以采用多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简单易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
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PCR引物设计的黄金法则1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。
引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。
3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。
开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。
当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。
另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。
你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是/。
第二步：贴上模板序列。
进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。
（附件Word文档里有图）在“Paste source seque nce below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。
注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。
首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。
默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。
第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。
第三个参数是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。
第四步：Pick primers：点一下这个按钮，符合你大小预期的primer 就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer 出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。
如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。
比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability OLIGO start len tm gc% any 3' seqLEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。
也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。
对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。
至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR 的干扰。
实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。
至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽空另做说明。
至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。
最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.手把手教你在线做PCR引物设计POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。
开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。
当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。
另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。
你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是/。
第二步：贴上模板序列。
进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。
（附件Word文档里有图）在“Paste source sequencebelow (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。
注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。
首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。
默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。