质粒拷贝数计算公式表格
质粒克隆
质粒克隆,转化及抽提操作流程一载体酶切:载体切2-5 µg vector1.在微量离心管中配制下列反应液, 全量定容至100 μlDNA sample 3-5μg10× Buffer 10 μlEnzyme A 2 μlEnzyme B 2 μlO up to 100 μlH237℃或酶的最适温度, 120分钟,2. Alkaline Phosphatase的去磷酸反应直接在从中促反应液中加10×Alkaline Phosphatase Buffer 12 μlCIAP(10~30 U/μl) 1 μlO 7 μldH2Total 120μl37℃反应60分钟。
三纯化:苯酚法a)加dHO至350μl(目的是减少纯化损失)2b)加350μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提1次。
仔细取上清,不要吸下层和中间蛋白质层。
取大约330μlc)加330 (要与3.2以的量相等)氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次。
取300μl上清。
(可能损耗15%)d 添加30 μl的3 M NaOAC(10分之一体积)。
e 添加750 μl的(2.5倍量)冷95%乙醇,在-20℃下保冷30分钟。
f 12000转,4℃离心,15 min,回收沉淀,g 用500 μl的70%冷乙醇(用95%制备)洗一次,12000转,4℃离心, 5 minh. 弃上清,反扣管口在清互的滤纸上吸净残余的上清,空气干燥10-15分钟。
I. 用水或TE Buffer溶解沉淀z。
具体如下2μg 20μl3μg 25 μl4μg 30 μl5μg 35 μl3.8 测OD,并在1%AGAROSE 电泳检测。
Note: 浓度需大于50ng/μl二.连接以下反应均在冰上操作。
在微量离心管中配制下列反应液, 全量定容至10 μl酶切载体100 ng待连接片断30-100 ng (载体摩尔数的1-3倍)2× T4 RAPID ligase buffer 5 μlT4 ligase (3U/μl) 1 μlO up to 10 μlH222℃连接1小时,或是过夜三.转化:1.连接产物5μl, 加100 μl感受态细胞DH5α,NOTE:如是质粒直接转化,通常只需要1 ng,,感受态细胞20 μl2.混均置冰上, 30 min,3.42度,热激60秒, 置冰上2 min 以上,4.加入900 μl SOC培养液, 37度,180 RPM , 1 小时5.取100 μl直接涂布于LB+ 50 ug/ml kan 的平板上6.6000 RPM 离心, 3 分钟, 弃上清,NOTE:若是质粒直接转化,无需离心,只需取5 μl-10μl直接铺板7.加100 μl SOC 培养液, 混均, 每块平板取100 ΜL涂布于LB+ 抗生素的平板上,8.37 度, 12-18 小时,NOTE:在使用AMP+时,时间长,可能会出现卫星克隆。
质粒拷贝数的测定方法
生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY1999年 第10卷 第1期 Vol 10 No.1 1999质粒拷贝数的测定方法周 涛摘要 在研究生物工程重组蛋白产量的过程中,质粒的拷贝数是一个需要重点考虑的参数,对它进行精确定量至关重要。
本文概述了几种主要的测定方法的原理和特点。
关键词 质粒拷贝数;测定方法Determination methods of plasmid copy numberZhou Tao(Institute of Biotechnology, Beijing,100071)Abstract Plasmid copy number, the number of expression vectors in each cell, is a key parameter in the study of productivity of recombinantmicroorganisms. Recognition of the importance of this parameter has givenrise to a number of methods for its determination. this article focuses on the principles and charactistics of these methods.Key words plasmid copy number; determination method细菌质粒是双链、闭环的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在一般情况下对宿主细胞的生存不是必需的,但质粒含有某些基因,可以补充细菌基因的不足,有利于细菌的生存。
质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶共同完成,在宿主中复制的程度差异很大。
质粒拷贝数指的是每个细胞中所含的质粒的个数。
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1~2次,而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10~200拷贝。
拷贝数计算公式
拷贝数计算公式
公式:V=s/t
在研究物理学中,V=s/t是一个非常重要的公式,它描述的是物体在运动的情况下的速度。
公式的含义是:V表示的是物体的速度,s 表示的是物体运动的距离,t表示的是物体运动的时间。
从这个公式可以看出,物体的速度是距离和时间的函数。
也就是说,物体的速度与它行走的距离和耗费的时间成正比例。
换句话说,当距离增加时,物体的速度也会增加;而当时间增加时,物体的速度就会减小。
这个公式也可以用于计算物体运动的距离。
例如,假如一个物体运动了10米,耗费了5秒钟时间,那么它的速度就可以用V=s/t来计算,即V=10/5=2m/s。
此外,这个公式也可以用于计算物体运动所耗费的时间。
例如,假如一个物体以2m/s的速度移动了20米,那么它运动所耗费的时间就可以用V=s/t来计算,即t=s/V=20/2=10s。
总而言之,V=s/t是一个非常重要的公式,它可以用来计算物体运动的速度、距离和时间。
它的使用范围很广,可以用于研究物理学、力学、航空学等多个领域。
克隆质粒的复制子以及在宿主菌的拷贝数
克隆质粒的复制子以及在宿主菌的拷贝数质粒,其复制子以及在E. coli宿主内的拷贝数质粒类型复制子拷贝数pUC18 pMB1* 500-700pKS(-) ColE1 300-500pBBR1系列载体 pBBR1 30-40pBAD322,pET等系列载体 pMB1-rop 15-20pACYC系列载体 p15A 10-15pSC101衍生载体 pSC101 5-10~15 (pir宿主菌如BW25141) pKD4, pR6KMCS R6K ~250 (pir-116宿主菌如BUN20) pJB866 RK2-trfA (oriV) mediumopBADTcTypeG pMB1 120 copies at 37C pECBAC1 oriS 1~2Genome One copy拷贝数是指每个细胞中有多少个质粒DNA的分子,质粒的拷贝数直接决定了:1. 从菌液中获得质粒DNA的量。
拷贝数和量成正比关系2. 以之为载体时转化子的数目。
拷贝数的高低和转化子的多少成正相关,是否线性不确切3. 筛选用抗生素的浓度。
拷贝数的高低和抗生素的使用浓度成正相关,如100,g/ml的氨苄青霉素筛选DH10B/pKS(-),也可以用50,g/ml;50,g/ml筛选DH10B/pBAD322;15,g/ml筛选整合至基因组上的抗性基因。
当菌株的筛选和培养出现非预期的情形,适当地调整抗生素的浓度就非常重要。
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 (Code:DV801A)提到4 ml的过夜培养的菌液中可纯化得到20 ,g质粒,以此推断,1.5ml 过夜培养含高拷贝质粒如pKS(-)的菌液中可得到多于5 ,g质粒,如溶于50 ,l TE/ddHO,则浓度约100ng/,l。
可参照此标准,来根据2不同拷贝数的质粒来推算本实验需要多少菌体、所提取质粒的量,再通过电泳后与分子量标准的比较来进一步估算出的DNA浓度。
DNA拷贝数的计算方法
DNA拷贝数的计算方法DNA拷贝数的计算方法分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml核酸浓度=(OD260)×稀释倍数×(33 或40 或50)=ng/ulMW 代表克/摩尔,单位dolton:1dolton 即表示1g/mol1 摩尔=6.02×1023摩尔分子(拷贝数)平均分子量(MW):dsDNA=碱基数×660 道尔顿/碱基ssDNA=碱基数×330 道尔顿/碱基ssRNA=碱基数×340 道尔顿/碱基得到拷贝数计算公式:6.02×1023拷贝数/摩尔×(浓度)/(MW g/mol)= copies/ml.即(6.02×1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例:3000 碱基质粒,浓度100 ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons,即1mol=1.98×106g(100ng×10-9)g/1.98×106=摩尔数copy 数=摩尔数×6.02×1023=3×1010copies/ul.1. dsDNA : (6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul= (9.12×1011)×(ng/ul)/(DNA length)2. ssDNA: (6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×330)=copies/ul= (1.82×1012)×(ng/ul)/(DNA length)3. ssRNA: (6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×340)=copies/ul= (1.77×1012)×(ng/ul)/(DNA length)。
计算copy数
做 qRT-PCR 的时候经常需要计算 DNA 拷贝数(Copy Number),比较烦,用下面的方法这就方便多了。
其实计算方法是相通的,只不过一个是带有分步推理过程,一个是直接计算而已!一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml核酸浓度=(OD260)×稀释倍数×(33 或 40 或 50)=ng/ulMW 代表克/摩尔,单位 dolton :1dolton 即表示 1g/mol 1 摩尔=6.02×1023摩尔分子(拷贝数)平均分子量(MW):dsDNA=碱基数×660 道尔顿/碱基ssDNA=碱基数×330 道尔顿/碱基ssRNA=碱基数×340 道尔顿/碱基得到拷贝数计算公式:mLmol g MW mL g mol mol copies /copies //)/copies 1002.6)/(1002.62323=⨯⨯=⨯⨯)()浓度((摩尔数 即(6.02×1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例:3000 碱基质粒,浓度 100 ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltonS=1.98×106g/mol ,即1mol=(100ng×10-9)g/1.98×106=摩尔数copy 数=摩尔数×6.02×1023=3×1010copies/ul.。
DNA拷贝数的计算方法
DNA拷贝数的计算方法
1A260吸光度值=ds DNA 50 ug/ml=ss DNA 33 ug/ml=ss RNA 40 ug/ml
核酸浓度=(OD260) x (dilution factor) x [33或40或50]=ng/ul
(6.02 x 10(23)次拷贝数/摩尔) x (浓度) / (MW g/mol) = copies/ml.
即:
(6.02 x 10(23)) x (g/ml) / (DNA length x 660) = copies/ml.
或
(6.02 x 10(23)) x (ng/ul x 10(-9) ) / (DNA length x 660) = copies/ul.
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例:
3000碱基质粒,浓度100 ng/ul,MW98 x 10(6) daltons,即1 mol =1.98 x 10(6) g。
[ 100ng x 10(-9) ]g/1.98 x 10(6)=摩尔数copy数=摩尔数x 6.02 x 10(23)=3x 10(10) copies/ul.
MW代表克/摩尔,单位dolton:1dolton即表示1g/mol
1摩尔= 6.02 x 10(23)次摩尔分子(拷贝数)
质粒相关问题
质粒相关问题因为高拷贝质粒稳定性低,而且给宿主细胞的压力大。
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1~2次,而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10~200拷贝。
高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid),独立于细菌细胞而自主复制;低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid),它们的复制随细菌染色体的复制同步进行。
一般来说,外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高,但是当拷贝数很大时,拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在。
这主要有两方面的原因:一方面,高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定,可能是由转录和翻译水平决定的;另一方面,高拷贝数的质粒往往很不稳定。
由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关,因此对于重组蛋白的生产来说,质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。
而且同一个细胞里一般不会同时有两种不同的质粒,这是质粒不相容性(plasmid incompatibility)。
在细菌细胞增殖过程中,其中必有一种会被逐渐排斥。
所以要用纯化过的低拷贝质粒。
低拷贝在鸟枪法测序中很常用的。
随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy),此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DNA片段装入适当载体,建立亚克隆文库,从中随机挑取克隆片段.最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列.1991年,Hunkapiller T等首先应用鸟枪策略分析了小鼠T细胞受体和靶位的94.6kb基因组. 19 95年,美国私立基因组研究所(TIGR)所长Venter JC率先应用鸟枪策略对微生物基因组测序并取得了成功.同年完成的流感嗜血杆菌的序列测定完全是用shotgun策略直接进行的.该实验充分证明了此策略是分析微生物基因组全序列的有效策略之一.从1998年起,Venter领导的研究小组对人类全基因组采用鸟枪战略测序DNA提出大胆构想,计划在三个层次上进行测序,即对每一层次克隆的两端的称为序列标签联结子(STC)的500bp进行测序.第一个层次用BAC做载体,插入片段为150kb,并计划构建30万个BAC克隆,对每个BAC两端的500bp直接测序,获得10%的人类基因组序列,平均每5kb就有一个500bp序列标记.第二层次是用低拷贝质粒作载体,插入10kb片段,构建500万个克隆,对克隆两端的500bp测序,得到50亿个碱基序列.第三层次是用多拷贝质粒作载体,插入2kb片段,计划构建3000万个克隆,再对每个克隆的500个碱基直接测序,可获得300 亿个碱基序列.由pUC演变而来的,一般能在细菌里高拷贝复制;pBR322演变而来的,一般为低拷贝。
质粒提取原理和方法
资料范本本资料为word版本,可以直接编辑和打印,感谢您的下载质粒提取原理和方法地点:__________________时间:__________________说明:本资料适用于约定双方经过谈判,协商而共同承认,共同遵守的责任与义务,仅供参考,文档可直接下载或修改,不需要的部分可直接删除,使用时请详细阅读内容质粒DNA提取的原理及方法碱裂解法质粒DNA提取原理质粒DNA提取主要包括以下几个方面:如何将细胞裂解释放质粒DNA,如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来,如何去除RNA污染,如何去除蛋白质和其它杂质。
质粒提取方法中,最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广,快速,纯度高等特点。
其原理是:强碱性条件下,质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来,并发生变性。
在pH中性,并有高盐浓度存在的条件下,质粒DNA会迅速发生复性,仍为可溶性状态,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构,在去垢剂SDS作用下,染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,通过离心去除沉淀后,再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA,用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。
BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒,采用碱裂解法质粒提取原理,在高盐环境下,采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA,而蛋白质不被吸附,最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来,方法简单,快速,质量好,收获量高。
影响质粒提取的因素影响质粒提取的因素有很多种,如质粒拷贝数,宿主菌株的种类,细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。
质粒拷贝数质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。
BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒,操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化,对于低拷贝质粒纯化提取,应加大起始菌液量的体积,并且相应地增加各种缓冲液的用量。
下表给出一些常用质粒载体的拷贝数:质粒种类复制起点拷贝数1 mL菌液质粒DNA收获量(µg) pSC101pSC10150.1-0.2pACYCP15A10-120.4-0.6pSuperCospMB110-200.4-1pBR322pMB115-200.6-1pGEMRMuted pMB1300-4006-7pBluescriptRColE1300-5006-8Muted pMB1500-7008-12宿主菌株宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。
拷贝数换算
小鼠基因组大小约为6×109Bp,则相对分子质量(MW)=6×109 Bp×660 Dalton1拷贝小鼠基因组的质量=MW/阿伏伽德罗常数≈6.6×10-12 g取400 ng野生型基因组DNA,按照以下公式计算对应的1细胞1拷贝质粒DNA的量,将两者混合作为PCR模板:W=[400×10-9/(6.6×10-12 g)]×[L×660/阿伏伽德罗常数]W:质量,g; L:质粒大小,bpC0500 的大小为5.9 Kb,取400 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0500质粒模板量为0.078 pg对应的1细胞1拷贝的C0500质粒模板量为0.392 pg对应的1细胞5拷贝的C0500质粒模板量为1.96 pg对应的1细胞25拷贝的C0500质粒模板量为9.80 pgC0560的大小为6 Kb,取400 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0560质粒模板量为0.08 pg对应的1细胞1拷贝的C0560质粒模板量为0.399 pg对应的1细胞5拷贝的C0560质粒模板量为1.995 pg对应的1细胞25拷贝的C0560质粒模板量为9.975 pgC0618的大小为9.3 Kb,取400 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0618质粒模板量为0.124 pg对应的1细胞1拷贝的C0618质粒模板量为0.618 pg对应的1细胞5拷贝的C0618质粒模板量为3.09pg对应的1细胞25拷贝的C0618质粒模板量为15.45 pgC0637的大小为7Kb,取400 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0637质粒模板量为0.093pg对应的1细胞1拷贝的C0637质粒模板量为0.465pg对应的1细胞5拷贝的C0637质粒模板量为2.325pg对应的1细胞25拷贝的C0637质粒模板量为11.625pgC0710的大小为3.8 Kb, 取400 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0710质粒模板量为0.05pg对应的1细胞1拷贝的C0710质粒模板量为0.252pg对应的1细胞5拷贝的C0710质粒模板量为1.26pg对应的1细胞25拷贝的C0710质粒模板量为6.3pgC0500 的大小为5.9 Kb,取100 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0500质粒模板量为0.0195pg对应的1细胞1拷贝的C0500质粒模板量为0.0975 pg对应的1细胞5拷贝的C0500质粒模板量为0.4875pg对应的1细胞25拷贝的C0500质粒模板量为2.4375 pgC0560的大小为6 Kb,取100 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0560质粒模板量为0.02 pg对应的1细胞1拷贝的C0560质粒模板量为0.1 pg对应的1细胞5拷贝的C0560质粒模板量为0.5 pg对应的1细胞25拷贝的C0560质粒模板量为2.5 pgC0618的大小为9.3 Kb,取100 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0618质粒模板量为0.031pg对应的1细胞1拷贝的C0618质粒模板量为0.155 pg对应的1细胞5拷贝的C0618质粒模板量为0.775pg对应的1细胞25拷贝的C0618质粒模板量为3.875pgC0637的大小为7Kb,取100 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0637质粒模板量为0.023pg对应的1细胞1拷贝的C0637质粒模板量为0.116pg对应的1细胞5拷贝的C0637质粒模板量为0.581pg对应的1细胞25拷贝的C0637质粒模板量为2.91pgC0710的大小为3.8 Kb, 取100 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0710质粒模板量为0.0125pg对应的1细胞1拷贝的C0710质粒模板量为0.0625pg对应的1细胞5拷贝的C0710质粒模板量为0.3125pg对应的1细胞25拷贝的C0710质粒模板量为1.5625pgC0720的大小为4.8Kb,取400 ng野生型基因组DNA做模板,对应的1细胞0.2拷贝的C0720质粒模板量为0.0638pg对应的1细胞1拷贝的C0720质粒模板量为0.319pg对应的1细胞5拷贝的C0720质粒模板量为1.595pg对应的1细胞25拷贝的C0720质粒模板量为7.97pg。
copy值计算方法
(6.02*1023)*( ng / ul*10-9)/ (DNA length*660) = copies/ul. 例子:
DNA浓度测定:我的浓度不是很高,但是也够用了,43ng/ul。
计算:
1、首先根据片断长度算出1ng中有多少个copies的产物:
720bp(片断长度)*2(双链DNA)*330(分子常数)=475200Mol
1*10-9(1ng*6.02*1023 )/475200=1.26*109copies
所以在1ng我的DED1提纯PCR(720bp)产物中,有1.26*109copies。
2、然后根据刚才的DNA浓度测定结果,计算每1ul的提纯产物中有多少copies。
43ng/ul*1ul*1.26*109copies=5.7*1010copies
所以根据计算结果,我们知道了在1ul提纯产物中有5.7*1010copies
首先根据片断长度算出1ng中有多少个copies的产物
copy值计算方法
核酸浓度及拷贝数计算公式
1A 260 吸光度值
ds DNA 50 ug/ml=ss DNA 33 ug/ml=ss RNA 40 ug/ml
核酸浓度=(OD260)* (dilution factor)*[33 或40或
Hale Waihona Puke 50]= ng/ul