酶活力测定的原理和方法
酶活力测定的一般原理和方法
酶活⼒测定的⼀般原理和⽅法酶活⼒测定的⼀般原理和⽅法（2012⼴东）29 ．（16分）⾷品种类多，酸碱度范围⼴。
⽣物兴趣⼩组拟探究在⾷品⽣产应⽤范围较⼴的蛋⽩酶，查阅相关⽂献，得知：（1）pH对不同蛋⽩酶的活⼒影响有差异。
据图12可知，_________更适宜作为⾷品添加剂，理由是________。
蛋⽩酶的活⼒可⽤________的量来表⽰。
（1）该蛋⽩酶的提取⼯艺流程如下：兴趣⼩组分别对酶保护剂浓度、提取液pH进⾏了探究实验。
结果显⽰，酶保护剂浓度在0.02～0.06mol/L范围内，酶活⼒较⾼；提取液pH在6.0～8.0范围内，酶活⼒较⾼。
他们认为，要进⼀步提⾼粗酶制剂的酶活⼒，以达到最佳提取效果，还需对酶保护剂浓度和提取液pH进⾏优化，并确定以此为探究课题。
请拟定该课题名称，设计实验结果记录表。
【答案】（1）⽊⽠蛋⽩酶由图可以看出，⽊⽠蛋⽩酶的活性不随pH的变化⽽变化单位时间内底物消耗（产物产⽣）（2）课题：探究酶保护剂的最适浓度和提取液的最适pH【解析】（1）审题结合图形和⽂字，在题⽬中已经提供了信息“⾷品种类多，酸碱度范围⼴”，所以选择的⾷品添加剂应该有较⼴的酸碱适应范围。
从图形中，可以看出⽊⽠蛋⽩酶的适应范围最⼴，所以可以选作⾷品添加剂。
酶的活⼒，⼀般⽤酶催化的底物消耗量或者产物⽣成量来表⽰。
（2）实验设计，应该明确实验⽬的：探究酶保护剂的最适浓度和提取液的最适pH值，所以可以将酶保护剂的浓度和提取液的pH值作为⾃变量，因变量为单位时间内底物的消耗量。
【试题点评】本题以蛋⽩酶在⾷品⽅⾯的应⽤为背景，考查了蛋⽩酶的应⽤、活⼒测定、蛋⽩酶的提取流程等内容和学⽣绘制表格的能⼒，难度不⼤。
（2009⼴东）38. （10分）⽣物技术实践汉⽔丑⽣的⽣物同⾏”超级群整理校对2012-7-5（1）商品化植酸酶主要来⾃微⽣物。
在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于⽔的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产⽣，可根据其⼤⼩选择⽬的菌株，所得菌株需要进⼀步测定植酸酶活性。
酶活力测定方法
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化 学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力 越高。
酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应 进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速 度的测定，求得酶的浓度或含量。
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化 量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速 度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶 量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适 宜。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
福林酚法测定蛋白酶活力原理
福林酚法测定蛋白酶活力原理1. 引言：蛋白酶的神秘面纱哎呀，说到蛋白酶，大家可能会觉得这玩意儿离我们有点远。
其实不然，蛋白酶可是咱们身体里忙前忙后、默默奉献的小工人。
它们像一群勤劳的清道夫，帮我们分解食物中的蛋白质，让营养更好地被吸收。
不过，有时候我们得搞清楚这些小工人到底干了多少活儿，这时候就需要用到福林酚法了。
说到这儿，可能有人要问：啥是福林酚法？怎么听起来这么高大上？别急，我这就给大家捋捋这其中的门道。
2. 福林酚法的基本原理2.1 蛋白酶活力的测定首先，福林酚法其实是个很聪明的办法，它可以用来测定蛋白酶的活力。
蛋白酶，顾名思义，就是能把蛋白质搞得七零八落的那种酶。
我们要知道它的活力，就得看看它把蛋白质分解的效率如何。
简单来说，就是用这套方法来测一测它干了多少活儿。
咋测呢？这就需要一点点化学的小窍门了。
2.2 福林酚法的步骤那么，福林酚法到底怎么操作呢？这个过程其实没那么复杂，只要几个步骤就能搞定。
首先，我们需要一种叫做“福林酚试剂”的化学液体。
这个试剂像是福尔摩斯，能准确找出蛋白酶分解蛋白质后剩下的东西。
接下来，我们会把待测的蛋白质样品和福林酚试剂混合，然后放到一个小瓶里。
再往里面加上另一种试剂，这时候，瓶子里的液体就会发生颜色变化。
这种颜色的变化，就告诉我们蛋白酶的活力到底如何。
明白了吧？简单来说，颜色越深，蛋白酶活力越强。
3. 实验操作的细节3.1 样品准备为了让实验结果更准确，我们需要对样品进行准备。
首先，得把蛋白质样品溶解成一定浓度的液体。
这个过程就像是在做一道美味的汤，得控制好原料的比例，才能保证最终的味道。
我们通常会用去离子水来溶解，这样可以避免杂质影响结果。
接着，样品需要经过过滤，确保液体里没有大颗粒的沉淀物。
这样一来，实验才会更靠谱，像是给蛋白酶干活提供了一个干净整洁的环境。
3.2 反应时间与测量接下来，就是关键的反应时间了。
通常，我们会让样品和试剂反应一段时间，这个时间的长短可是有讲究的，太短了可能测不出准确的结果，太长了又可能产生误差。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法纤维素是一种多糖，由若干葡萄糖分子通过β-1，4-糖苷键连接形成，具有结构特殊，难于降解的特点。
纤维素酶是能够降解纤维素的酶，广泛存在于微生物、植物和动物体内。
测定纤维素酶活力的方法因纤维素酶的种类及应用领域不同而有所区别，常用的方法包括酚-硫酸法、精胱酸法、流变法、荧光法等。
下面将介绍其中几种常用的方法。
一、酚-硫酸法酚-硫酸法是用于测定纤维素酶活力的经典方法之一、其原理是：纤维素酶通过水解纤维素生成还原糖，而还原糖可以与试剂酚和硫酸反应产生可测定的颜色。
具体步骤如下：1.准备试剂：将1%酚（重量/体积）和10%硫酸（体积/体积）混合，剧烈振荡。
2.取一个容量瓶，加入待测纤维素酶样品、适量的底物纤维素和适量的缓冲液（常用pH5.0的酸性缓冲液）。
3.进行恒温反应：将试剂和底物溶液在适当的温度下进行恒温反应。
4.终止反应：在特定的时间点，取出反应溶液，加入刚刚准备好的酚-硫酸试剂，充分混匀。
5.酚-硫酸试剂与还原糖反应产生胶体，表现为紫褐色。
通过比色计或分光光度计测定产生的胶体的吸光度，根据标准曲线或已知纤维素酶活力的对照样品，计算出待测样品的纤维素酶活力。
二、精胱酸法精胱酸法是另一种常用的测定纤维素酶活力的方法。
其原理是：纤维素酶通过水解纤维素生成还原糖，而还原糖可以与精胱酸反应产生尿糖胺，尿糖胺与酚胺反应形成可测定的色素。
具体步骤如下：1.准备试剂：将精胱酸磷酸缓冲液（常用pH4.8）和4-氨基安替比林（ABTS）或3,3'-二氮杂联苯基过氧化物（DPPH）溶液混合，剧烈振荡。
2.取一个容量瓶，加入待测纤维素酶样品、适量的底物纤维素和适量的缓冲液。
3.进行恒温反应：将试剂和底物溶液在适当的温度下进行恒温反应。
4.终止反应：在特定的时间点，取出反应溶液，加入刚刚准备好的精胱酸试剂，充分混匀。
5.精胱酸试剂与还原糖反应产生色素，根据色素的吸光度，通过分光光度计测定产生的色素的吸光度，根据标准曲线或已知纤维素酶活力的对照样品，计算出待测样品的纤维素酶活力。
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂1. Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 .2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. L 氢氧化钠溶液4. L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。
[知识]两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
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检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
酶的活力测定的原理是
酶的活力测定的原理是
酶的活力测定原理是通过测量酶催化下的反应速率来间接测定酶的活力。
一般情况下，可以在一定温度、pH值和底物浓度下进行反应，然后通过测量反应产物的生成速率或底物的消耗速率来确定酶的活力。
常用的酶活力测定方法有比色法、荧光法、化学发光法、电化学法等。
其中，比色法是最常用的方法之一。
比色法的原理是将产物或底物与某种试剂作用，使其产生特定的吸光度变化，然后根据吸光度的变化来计算酶的活力。
03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
实验三. 碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活性的测定
低温酶学
五、pH 对酶反应的影响
最适pH时的酶 最适 时的酶 活力最大
•最适 因酶而异， 最适pH因酶而异 最适 因酶而异， 多数酶在7.0左右 多数酶在 左右 •是酶的特性之一 是酶的特性之一
连续监测法所需仪器
仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、 高速冷冻离心机、微量移液器等
过氧化物酶活力的测定
操作步骤
一、酶液提取
分别精确 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约 精确 5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓 冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。 将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。
酶活性单位(U 酶活性单位 )
按照国际酶学会议 的规定，1个酶活 力单位是指在25℃ 、测量的最适条件 （指最适pH、温 度等）下，1分钟 内能引起1微摩尔 底物转化的酶量。
术语酶活力指的是 溶液或组织提取液 中总的酶单位数。
在酶的纯化过程中 常用到另一个术语 （specific activity） ）
比活
是指每毫克蛋白含有的酶单位数。 是指每毫克蛋白含有的酶单位数。随着 毫克蛋白含有的酶单位数 酶纯化的进行，比活会越来越高， 酶纯化的进行，比活会越来越高，当酶 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 所以比活是酶纯化程度的指标 指标。 所以比活是酶纯化程度的指标。
双分子反应、 双分子反应、一级反应
酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程 、
1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 年 和 提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－ 物浓度关系的数学方程式 ，即米 － 曼氏方程 简称米氏方程(Michaelis equation)。 式，简称米氏方程 。
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
福林酚法测定蛋白酶活力原理
福林酚法测定蛋白酶活力原理1. 什么是福林酚法？福林酚法，这个名字听上去有点复杂，但其实就是一种测定蛋白酶活力的办法。
简单来说，它就像是蛋白酶的“测谎仪”，用来告诉我们这些酶到底有多能干。
要理解这个方法，我们先得知道什么是蛋白酶。
蛋白酶，顾名思义，就是能把蛋白质搞得七零八落的“拆家伙”。
它们在生物体内的作用可大了，像是消化酶，它们的“工作”就是分解我们吃下去的食物中的蛋白质。
2. 福林酚法的工作原理2.1 准备材料好，咱们先说说准备工作。
你得有几个“主角”，分别是蛋白质底物、蛋白酶、福林酚试剂和氢氧化钠。
底物就是我们用来测试的“蛋白质样品”，而福林酚试剂则是测定结果的“显色剂”。
氢氧化钠用来调整酸碱度，确保反应顺利进行。
2.2 反应过程这个过程就像是做菜一样。
首先，把蛋白质底物和蛋白酶混合，放在一定温度下孵育一段时间。
这时候，蛋白酶开始“拆解”蛋白质了。
接下来，加入福林酚试剂，它会和被分解出来的小分子反应，变成有颜色的化合物。
颜色的深浅，就像是菜的颜色一样，直接反映了反应的程度。
然后，我们用光度计来测量这个颜色，颜色越深，说明蛋白酶的活力越强。
3. 数据分析和结果解读3.1 数据分析有了测量数据后，我们得拿出计算器了。
通过比色计测得的光吸收值，可以告诉我们有多少蛋白质被分解了。
这时候，咱们要把这些数据代入标准曲线中，得出最终的结果。
标准曲线就像是我们的“食谱”，按照它来判断蛋白酶的活力高低。
3.2 结果解读结果解读这一步就像是看天气预报一样。
通过分析，我们可以知道蛋白酶的活力究竟如何。
如果蛋白酶的活力高，那说明它的“拆家”能力强；如果低，那可能就是“效率不高”了。
这样，我们就能了解蛋白酶的实际情况，为后续的实验提供依据。
4. 实际应用福林酚法可不仅仅是在实验室里用得上，它在很多领域都有实际应用。
比如，在制药行业，它能帮助我们评估药物的效果；在食品工业，它可以帮助检测食品中的酶活性，确保食品的质量。
酶活力的测定方法
实验四α-淀粉酶实验活力的测定方法一、实验目的了解并掌握淀粉酶的测定步骤，掌握其方法。
二、实验原理液化型淀粉酶（α-淀粉酶）能催化水解淀粉，生成分子较小的糊精和少量的麦芽糖及葡萄糖。
本实验利用呈色反应来测定液化型淀粉酶水解淀粉作用的速度，从而测定淀粉酶活力的大小。
三、器材和试剂1.器材多孔白瓷斑、50ml三角瓶或大试管（25mm*200mm）、恒温水浴箱、烧杯、容量瓶、漏斗、吸管、纱布。
2.试剂（1）原碘液称取I211g、KI22g，加少量水完全溶解后，再定容至500ml，于棕色瓶中保存。
（2）稀碘液吸取原碘液2ml，加入KI20g，用蒸馏水溶解定容至500ml，于棕色瓶中保存。
（3）标准“终点色”溶液。
①准确称取氯化钴40.2439g、重铬酸钾0.4878g,加水溶解并定容至500ml。
②0.04%铬黑T溶液。
准确称取铬黑T40mg，加水溶解定容至100ml。
取①液80ml与②液10ml混合，即为标准色。
冰箱保存。
（4）2%可溶性淀粉称取烘干可溶性淀粉2.00g，先一少许蒸馏水混匀，倾入80ml沸水中。
继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100ml。
此溶液需要新鲜配制。
（5）0.02mol/L、pH6.0磷酸氢二钠溶液称取Na2HPO4·12H2O45.23g和C6H8O7·H2O8.07g,用蒸馏水溶解定溶至1000ml，配好后以酸度计或精密试纸校正pH。
（6）α-淀粉酶粉。
四、操作步骤1.待测酶液的制备（1）精密称取酶粉1-2g，放入小烧杯中。
（2）用少量的40℃0.02mol/L(恒温水浴箱中进行) pH6.0的磷酸氢二盐-柠檬酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研3-4次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀，通过四层纱布过滤，滤液供测定用。
（如为液体样品，可直接过滤，取一定量滤液入容量瓶中，加入缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，备用。
）2.测定（1）将“标准色”溶液滴于白瓷板的左上角空穴内，作为比较终点色的标准。
酶活性的测定
计算公式
每克鲜叶APX的酶活性U= （X×7.5×1000×60×1000）/ （m×2.8×20×10） 上式中，X：OD值的变化；7.5：每克材料 提取7.5mL粗酶液；1000：将ml转化成µL； 60：将1min转化成60s；1000：将mmol转化 成µmol；m：鲜叶的重量，单位为g；2.8： 吸光系数mmol/L cm；20：用20µL酶液进行 活性测定；10：每10s记录吸光值的变化。
过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含 过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡 后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。 近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该 酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳） 和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。
方法比较：
研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度 低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量 的样品测定。其优点是不需要任何特殊的 仪器，适用性比较广泛。 紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、 快速、检测线相对较低得到优点。但是对 于测定底物或产物改变量方面不太准确。
总结：
综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于 过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应 生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根 据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时， 影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、 酸度、温度及重金属的含量等；并且各种方法的 准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定CAT 活性时，应该根据具体组织种类及测量要求选择 适合的测定的方法。
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B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
切勿反復 凍結-解凍。
酵素失活的原因
• • • • • 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑：
酶反应速度曲线
产 物 浓 度 斜率＝浓度/时间＝V 时间
酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。
酶活力的测定
• 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 • 必须测定酶反应的初速度。 • 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10 倍。 • 酶浓度必须适合。
1、化学法
• 化学法是利用化学反应使产物变成一个 可用某种物理方法测定的化合物。如根 据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来 计算酶的活性。
2、放射性化学法
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
1、一般的连续法
• A 光谱吸收法 • 该法主要指分光光度法和荧光法。分光 光度法是利用反应物和产物在紫外和可 见光部分光吸收不同，选择一适当的浓 度，连续测定读出反应过程中光吸收的 变化。该法适用于一些反应速度较快的 酶。自动记录仪的普遍使用使该法更容 易被人们接受。
• 脱氢酶以NAD+或NADP+或作为辅酶，反应中形成 NADH或NADPH ，340nm处可以观察到光吸收的变 化。 • NAD （ P ） H 在 340nm 处吸收光后发射出 460nm 的 光。因而，需这两个辅因子的任何反应都可用 荧光法测定。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
• 经同位素标纪的底物在酶活力测定中有很重要 的价值，用于标记的同位素一般有：
• 当同位素衰变时放出β 射线（粒子）。 • 放射性化学法原理与化学法相似，但反应终止 后，必须把放射标记的底物与产物分离，多用 层析和电泳法，然后测定产物（或底物）的放 射性，就可得知酶的活性。
3、酶偶联法
• 有一些酶促反应的产物不易直接测定，需加入一指 示酶转变成可测定的产物如测定葡萄糖氧化酶的反 应速度： • β —D—葡萄糖+ O2 →葡萄糖酸内酯+H2O2
D 量热法
• 由于在反应过程中有反应热的变化，用 非常灵敏的量热计可以测定酶来
逐渐引起了人们的重视。
E 旋光法
• 在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有 所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶 反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物 来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比 旋络合物，故可用旋光计跟踪 LDH 催化的乳酸 和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由 于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采 用
酶的分析检测技术
• 酶促反应分析 • 酶活力测定方法 • 常见酶类的活力测定方法
維持酵素活性緩衝液
• 緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子 濃度，兩者都會影響酵素的活性 • 經常在緩衝液中加入一些物質，以增加 酵素安定或保持活性 • 溫度的影響 • 濃度的影響
試劑的保存
• • • • 避免潮解 分裝凍藏: 甘油凍藏 避光防菌
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
术主要基于酶促反应的初速度原理，下
面介绍两种方法。
定时法
• 定时法是指在线性范围内，定时记录反 应过程中读数的变化（如吸光度），由 于这一变化值直接正比于初速度，故可 分析出相应的物质浓度。 • 这种分析仪多用分光光度法检测或选用 离子选择性电极，对大批量样品进行单 一成分分析或对每一样品进行多因素分 析，效率很高。
此反应可用量气法或氧电极法测定，但通过一指示酶二过 氧化物酶催化的反应测定吸收光谱的变化更为方便准确。
• H2O2 +色原（如愈创木脂）→H20+O2+染料
测定酶活力
• 中止反应法或连续反应法进行 • 中止反应法 • 在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一 定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使 酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底 物的消耗量。这是最古典的但仍是经常使用的 方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理，设 计测定其活力的具体方法。