结核病实验室ppt课件
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五、结核和利福平耐药的快速分子 鉴定(x-pert)
适用范围: 1、TB复合群鉴定。 2、利福平耐药检测 。 原理:多重PCR扩增和反向杂交来识别。 可以在2小时出报告结果。
实验室方法
痰标本的前处理:同前方法。 试剂加入去污处理的痰标本中。 室温下手工晃动密闭痰盒,15分钟内2次,然 后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含相 当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理的痰 液),检测盒放入检测平台。 MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。
rpoB基因突变位点:13个位点。 katG基因突变位点:2个位点。 /inhA基因突变位点:2个突变位点。
耐药分子诊断的基本原理
操作较复杂。 特异度与灵敏度不高。 基因芯片耐多药检测试剂已获得欧盟体外 诊断试剂证书(CE-IVD)。 中国药品食品监督管理局的医疗器械证书。 可以作为临床耐药结核病临床诊断和治疗 的依据。
灵敏 特异 度 度 培阳 97.6 0 % -
涂阳培阳
99.8 0 %
90.2 0 %
适用范围: 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理:多重PCR扩增和反向杂交来识别。
基因芯片
将核酸片段有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚 丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二 维分子排列。 采用光导原位合成或微量点样等方法。 然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。 通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机 (CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测 分析,从而判断样品中靶分子的数量。 ,
适用范围: 1、TB的诊断 2、一线抗结核药物耐药诊断 3、二线抗结核药物耐药的诊断 4、目前,利福平(rpoB基因) 、异烟肼(Kat基 因、inhA基因)耐药的诊断
所需仪器设备:生安柜、超声振荡仪、PCR扩增 仪、可调温振荡仪
原理:基于分子生物学扩增技术。 rpoB基因突变位点有:4个
重大专项:泰兴、江阴地区部分实验结果比较
阳性检出率 标本及性状 754份痰标本 脓性痰 非脓性痰 即时痰 夜间痰 液基法 23.50% 47.50% 13.50% 20.48% 25.6% 直涂法 16.80% 40.90% 4.66% 15.06% 17.01%
三、线性探针耐多药检测方法(HAIN)
耐药检测基因芯片
基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性,通 过PCR扩增和核酸杂交技术,检测荧光信号的有无,判断 特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。 结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基 因突变,快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性 (利福平、异烟肼)。
四、结果判读
试剂质控 位点质控
HAIN和目前常规药敏方法比较
比较项目 时间 生物安全级别要求 人员培训 操作简易程度 仪器设备 HAIN 1-2天 较低 2-3天 简单 性价比较高 常规药敏方法 2-3个月 二级实验室 2-3个月 复杂 --
对环境洁净度要求
较高,易出现 假阳性
较高
四、GENECHIP基因芯片耐多药 检测技术
Kat基因、inhA基因突变位点有:2个、4个
正确流程
痰液前处理
MIX制备
DNA提取
PCR
杂交
操作步骤
一、痰标本处理 去污染前处理液:氢氧化钠+柠檬酸三钠+N-乙 酰半胱氨酸。 痰标本+等体积去污染前处理液:振荡-离心-静 置-PBS清洗-离心-留取沉淀。 二、DNA提取 处理后痰标本沉淀 : 95°C孵育-超声裂解-取 上清液用于PCR扩增。 三、扩增产物杂交 PCR产物变性,与探针试条上的标记突变位点杂 交,标记物显色。
10%
不需要空调设施 不需要暗室 诊断性能优于标准荧光显微镜 寿命长(~ 15-20,000小时) 荧光染色液有致癌作用,推荐自动染色机。 涂片需避光低温保存。 需加强操作人员的培训和质量控制。
• 成本低廉,价格低于现有的光学显微镜。
Байду номын сангаас
适合县、乡级基层实验室使用。
二、液基夹层杯技术
结核病实验室
发光二极管荧光显微镜(LED)方法 液基夹层杯技术 线性探针耐多药检测技术(HAIN) 基因芯片耐多药检测技术(GENECHIP) TB和利福平耐药快速分子鉴定(X-Pert)
一、发光二极管荧光显微镜(LED) 方法
适用范围:痰涂片镜检 所需试剂/仪器: LED显微镜、荧光染色液 中盖项目:淮安市(淮阴区、楚州区) 原理:
实验室方法
阳性培养物经MPT64抗原检测以确定其是否属于 结核分枝杆菌菌属。 L-J培养基比例法药敏 /MIGT 快速药敏法。 常规的DNA核酸扩增 hain方法检测耐药
实验室方法
试剂分别按2:1和3:1加入未经处理的痰标本 和去污处理的痰标本中。 室温下手工晃动密闭痰盒,15分钟内2次, 然后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含 相当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理 的痰液),检测盒放入检测平台。 MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。
发光二极管荧光显微镜(LED)
镜下视野
发光二极管荧光显微镜(LED)
不需要加热玻片,步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍
• 对数目少的不必使用镜油
• 节省人力时间,时间为普通的 1/4 每天可检查至少 60 个涂
片
• 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度,与 ZN 相比阳性发现率平均增加
适用范围:痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项:泰兴、江阴 厂家:湖南天骑公司 原理:集菌法
流程图 痰标本消化灭活 基片的夹层杯 离心 细菌附着在基片 在夹层杯中 直接染色 取出基片 于载玻片上 镜检 自动阅片计算机报告系统。
所需仪器设备:普通的抗酸染色液、彭氏杯 (专利)、涂片机、KP21型快速干片机、抗 酸杆菌自动阅片计算机报告系统。