第五章 微生物药物产生菌的菌种选育

青霉素诱变史 青霉素诱变史 时间 1943 1943 1943 1945 1955 1971 1977 目前 发酵单位(U/ml) 发酵单位 100 250 500 ～850 ～8000 ～2万 万 ～5万 万 5～10万 ～ 万
微生物的潜力是无穷的。 微生物的潜力是无穷的。 是无穷的
我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、 我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、 辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态” 辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态”后生产 出来的， 出来的，是“人定胜天”的结果。 人定胜天”的结果。
杂交和转基因 杂交是同种或近似种之间的交配， 杂交是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太 是同种或近似种之间的交配 这里关于种的定义是经典的生殖隔离， 远。这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这 骡子就是异种杂交的例子。 个，骡子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是 在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。 在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。 转基因在本质上不同 转基因在本质上不同 。以BT（Bacillus thuringiensis产生的可 （ 产生的可 抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害） 抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害）为 没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。 例，没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。这 个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。 个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗传 物质传递的现象，但是很少，也不可预期。 物质传递的现象，但是很少，也不可预期。 自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。 自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。
丘成桐, 丘成桐, 2010 沃尔夫数学奖
袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物， 袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物， 是由于其重大的经济价值， 是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的 开发和理论研究方面已走到了世界的前列。 开发和理论研究方面已走到了世界的前列。 恰恰相反， 恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差 距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂 袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、 交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？ 交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的 遗传基础是什么？ 遗传基础是什么？ 这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。 这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。这种 理论研究具有更为重大的学术价值， 理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开 发产生深远的影响。 发产生深远的影响。
如果A以亚氨基形式出现，在DNA合成到达这一位置的 如果 以亚氨基形式出现， 合成到达这一位置的 以亚氨基形式出现 瞬间，通过 多聚酶的作用， 瞬间，通过DNA多聚酶的作用，新合成的 多聚酶的作用 新合成的DNA链上的 链上的 相对位置就是C，而不是 相对位置就是 ，而不是T 。 如Τ以稀有的烯醇式形式出现，则错配G，而不是 。 以稀有的烯醇式形式出现， 错配 ，而不是A
浅蓝菌素(cerulenin) 通过抑制聚酮体的前体 (也是脂肪酸前 通过抑制聚酮体的前体 浅蓝菌素 小分子酸类的合成而抑制聚酮体类抗生素的产生 产生， 体)小分子酸类的合成而抑制聚酮体类抗生素的产生，因此 筛选在适当浓度的浅蓝菌素琼脂平板上的生长 菌落即可能 筛选在适当浓度的浅蓝菌素琼脂平板上的 生长菌落即可能 生长 获得高产菌株。 获得高产菌株。 高产菌株 道诺霉素产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生 产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生长 将 道诺霉素 产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生 长 后 ， 长出的菌落大多数因抗生素的生物合成被抑制而表现 为无色， 呈现红色的即为产生抗生素的菌落， 这样获得高 为无色 ， 呈现红色的即为产生抗生素的菌落 ， 产菌株的机率就得到提高。 产菌株的机率就得到提高。
我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。 我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。
自发突变(spontaneous mutation)：自然条件下 菌株也 自发突变 ：自然条件下, 会发生遗传或生理上的变化而造成产量的改变。 会发生遗传或生理上的变化而造成产量的改变。突变有 着正向和反向的差别。 着正向和反向的差别。 在无性繁殖的细菌中,突变率是用每一个细胞世代中每 在无性繁殖的细菌中 突变率是用每一个细胞世代中每 个细菌发生突变的概率， 个细菌发生突变的概率，即用一定数目的细菌在一次分 裂过程中发生突变的次数表示, 裂过程中发生突变的次数表示 约 10-8 。 不同生物和同 一生物个体的不同基因的自发突变率不同。 一生物个体的不同基因的自发突变率不同。 自发突变因素 自发突变因素: 因素 宇宙射线 环境中的低浓度物质 温度的改变
自发突变的机理之互变异构效应假说
腺嘌呤(A)和胞嘧啶 的第六位可以氨基或亚氨基形式出现 腺嘌呤 和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亚氨基形式出现，而 和胞嘧啶 的第六位可以氨基或亚氨基形式出现， 鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶 的第六位可以酮式或烯醇式出现 鸟嘌呤 和胸腺嘧啶(T)的第六位可以酮式或烯醇式出现。平衡 和胸腺嘧啶 的第六位可以酮式或烯醇式出现。 一般倾向与氨基和酮基配对，即DNA双链一般以 一般倾向与氨基和酮基配对， 双链一般以AT ,GC为主。 为主。 基配对 双链一般以 为主
诱变处理的兴起 诱变处理的兴起 1927年,美国遗传学家缪勒 年 美国遗传学家缪勒 美国遗传学家缪勒(H.J.Muller,1890—1967) 首次发现用X射线照射果蝇精子后 首次发现用 射线照射果蝇精子后，果蝇后代发生突变 射线照射果蝇精子 的个体数大大增加。同年 又有科学家用 射线和γ 又有科学家用X射线和 的个体数大大增加。同年,又有科学家用 射线和γ射线 照射玉米和大麦的种子，也得到了类似的结果。 照射玉米和大麦的种子，也得到了类似的结果。 第二次世界大战期间， 第二次世界大战期间，科学家发现了第一个化学诱 变剂——芥子气，开辟了化学诱变的新途径。 芥子气，开辟了化学诱变的新途径。 变剂 芥子气 从此， 从此，利用各种物理的和化学的手段进行人工诱变 的工作在世界范围内广泛开展起来。 的工作在世界范围内广泛开展起来。
2004年1月13日，沃尔夫农业奖由中国的袁隆平与美国康 年 月 日 奈尔大学的塔克斯莱(Steven Tanksley)分享，以表彰他们“对 分享， 奈尔大学的塔克斯莱 分享 以表彰他们“ 杂交水稻所做出的开创性研究和发现杂交优势的基因原理” 杂交水稻所做出的开创性研究和发现杂交优势的基因原理” 。 袁隆平从实践及推理中突破了水稻为自花传粉植物而无 杂种优势的经典观念的束缚, 成为继陈省身(沃尔夫数学奖 及 杂种优势的经典观念的束缚 成为继陈省身 沃尔夫数学奖)及 沃尔夫数学奖 吴健雄(沃尔夫物理学奖 之后第三个中国人。 吴健雄 沃尔夫物理学奖) 之后第三个中国人。 沃尔夫物理学奖
经典(常规 育种 经典 常规)育种：诱变育种 常规 育种： 诱变育种 (induced mutation): 利用物理或化学诱变剂 ) (mutagen)处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率 处理均匀分散的微生物细胞群， 处理均匀分散的微生物细胞群 大幅度提高，然后设法采用简便、快速、 大幅度提高 ， 然后设法采用简便、 快速 、高效的筛选方 从中挑选少数符合目的的突变株(mutant)， 以供生 法 ， 从中挑选少数符合目的的突变株 ， 产科研之用。 产科研之用。 步骤：出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。 步骤：出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。
2009年 2009年，中国颁发了具有自主知识产权的一个转植酸酶基因玉 米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次） 米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次）的生产 应用安全证书。 应用安全证书。 引发公众转基因食品安全性大争论。 引发公众转基因食品安全性大争论。 中国工程院院士范云六： 中国工程院院士范云六：转植酸酶基因玉米可以提高饲料的利 用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本； 用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减少 动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护。 动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护。 此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、 此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、低 成本的优势。 成本的优势。 中国工程院院士张启发： 中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟虫 等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80% 80%的化学农药 等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%的化学农药 用量。 用量。
第五章 微生物药物的菌种选育
育种(strain improvement) 是指为改善种质对原 育种 ( ) 出发菌株(作物)进行的遗传操作。 出发菌株(作物)进行的遗传操作。
微生物药物菌种选育的目的： 微生物药物菌种选育的目的： 菌种选育的目的 提高产量 组份优化 新化合物的获取
基因突变是一切突变的内因。 基因突变是一切突变的内因。 任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生菌 任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定， 遗传物质的任何变化， 遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产量 和性质。 和性质。 微生物的生理条件、培养条件、 微生物的生理条件、培养条件、发酵条件等在育种 发面也有着重要作用。 发面也有着重要作用。
五、根据产物特点而设计实验 β内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗菌 作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味着 作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株， 提高浓度的β内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性， 提高浓度的β 内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性， 即得到了高产菌株。 即得到了高产菌株。
诱变育种两个主要的环节：诱变( 诱变育种两个主要的环节：诱变(induction)、筛选(screening) ) 筛选( )
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出发菌株的选择： 出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液 诱变剂的选择： 诱变剂的选择：简便有效 诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂， 诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质 诱变剂量的选择
菲律宾的国际水稻研究所已开发出的“ 金大米” 菲律宾的国际水稻研究所已开发出的 “ 金大米 ” ， 通过转基因技术让水稻制造β胡萝卜素 维生素 通过转基因技术让水稻制造 胡萝卜素(维生素 的前 胡萝卜素 维生素A的前 有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏 体), 有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素 缺乏 症。 2005.3, 英国剑桥先正达种子公司 英国剑桥先正达种子公司(Syngenta Seeds)报 报 道了第二代转基因“金大米” 胡萝卜素 防止失 胡萝卜素(防止失 道了第二代转基因“金大米” 明)含量增加了 倍。” 含量增加了20倍 含量增加了 国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量， 国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量， 以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中， 以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中， 大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。 大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。
突变株的筛选方案的设计
高产突变株的筛选： 高产突变株的筛选： 形态突变株的筛选： 形态突变株的筛选： 自身耐药突变株的筛选： 自身耐药突变株的筛选：
化合物抗菌活性的琼脂块法 去除色素， 去除色素，孢子等 产量越高， 产量越高，对自身的抗性就越强
营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制 营养缺陷型突变株的筛选： 结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其抗性水平高的变 结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其抗性水平高的变 对其抗性水平高的 可解除反馈抑制而提高产量。 而提高产量 株，可解除反馈抑制而提高产量。