质粒DNA的提取分析

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质粒DNA的提取

一、原理

采用碱变性法抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、方法

1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌,接在含有100μ

g/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(5ml/15ml试管)中,37℃震摇培养过夜。

2.将1.5ml菌液加入微离心管中,14000r/min,离心10秒,其取上清液。反复数次,收

集全部菌体。

3.倾去上清,滤纸吸干。

4.加30μlTE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0),振荡起菌体。

5.加30μlTENS溶液(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS),震荡10秒至溶液变粘稠。

6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S,14000r/min,离心3分钟,沉淀细胞碎片及染

色体DNA。

7.上清液转移至另一微离心管中,加等体积胞和酚,混匀,12000r/min,离心2分钟。

8.上层水相转移至另一位离心管,加2倍量冷水乙醇,14000r/min,离心20分钟。9.倾去乙醇,加入7o%冷乙醇淋洗。

10.倾去乙醇,滤纸吸于,真空抽吸2~3分钟。

lI.加人50μlTE缓冲液,溶解DNA。

12,加入1μl核糖核酸酶(10mg/m1),14000r/min,离心2s,使核糖核酸酶与管底液体混匀。

13.37℃水浴30min。

14.样品放一20℃冰箱保存备用。

三、试剂

1.TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)

配制方法:

Tris 1.211g

EDTA.Na 0.037g

用800ml重蒸水溶解,用分析纯盐酸调整pH至8.0,加重蒸水定容至1000ml。2.TENS溶液:(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)

配制方法:

NaOH O.4 g

SDS 0.5 g

加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.

3.3.0mol/1醋酸钠溶液(pH5.2)

配制方法:醋酸钠 24.6g

用70ml重蒸水溶解,再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。

纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体,使用之前必须重蒸,除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解,重新进行蒸馏,当温度升至183℃时,开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等体积的lmol/L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液,立即加盖,激烈振荡,并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中,并加一定体积0.1mol/L Tris-HCI(pH8.o)覆盖在酚相上,置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂,能引起腐蚀性损伤,操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚,应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红,要随时加盖,也可加入抗氧化剂o.1%8一羟基喹啉及o.2%β—巯基乙醇。

5.无水乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

6.70%乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

7.核糖核酸酶(10mg/ml)

配制方法:称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA,美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内,加1 ml 100mmol/pH5.0的NaAC溶液(完全溶解),即为10mg/ml RNase,为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase,置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min,然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。

四、材料

1.菌种:

大肠杆菌(pUC57)

2.培养基

LB液体培养基

精解蛋白胨 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化钠 3 g

葡萄糖 0.6g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示,下同)溶解至300ml。用10mol/LnaOH 调

pH至7.2~7.4。分装于15ml试管中,每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm2灭菌20min.

l抗菌素:

氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中,浓度为100mg/m1。

五、仪器:

恒温振荡器。

低温冰箱-20℃

真空泵。

台式高速离心机

六、说明

1.质粒DNA提取的方法很多,有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种,但基本原理和步骤是一致的.包括下述步骤:(1)裂解菌体细胞;(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐

等。

2.在基因操作实验中.保存或提取DNA过程中,一般都采用TE缓冲液,而不选用其它的缓冲液。虽然很多缓冲系统.如磷酸盐缓冲系统,硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围,可以作为DNA的保存液,但在某些实验中,这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中,要用到Ca+,如果川磷酸盐缓冲液,磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀;在各种工具酶反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高盐离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris—HCI缓冲系统,不存在金属离子的干扰作用;作中的EDTA是二价离子

Mg2+、Ca2+等的螯合剂,可降低系统中的这些离子浓度,而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅助因子,所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

3、TENS中NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定,怛当pH大于12或小于3 时,就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12,因而使染色体DNA与质粒DNA变性。

TENS中的SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;(2)解聚细胞中的核蛋白;(3)SDS能与蛋白质结合

成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核

糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去干净,防止在下一步操作中(用Rnase去除RNA时)受干扰。

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