质粒DNA的提取分析

质粒DNA的提取

一、原理

采用碱变性法抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、方法

1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μ

g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。

2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收

集全部菌体。

3.倾去上清，滤纸吸干。

4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。

5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。

6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染

色体DNA。

7.上清液转移至另一微离心管中，加等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。

8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。

10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。

lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。

12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。

13．37℃水浴30min。

14．样品放一20℃冰箱保存备用。

三、试剂

1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)

配制方法：

Tris 1.211g

EDTA.Na 0.037g

用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)

配制方法：

NaOH O.4 g

SDS 0.5 g

加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.

3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)

配制方法：醋酸钠 24.6g

用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。

纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris-HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．1％8一羟基喹啉及o．2％β—巯基乙醇。

5．无水乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

6．70％乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

7．核糖核酸酶(10mg／ml)

配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即为10mg／ml RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。

四、材料

1．菌种：

大肠杆菌(pUC57)

2．培养基

LB液体培养基

精解蛋白胨 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化钠 3 g

葡萄糖 0.6g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH 调

pH至7．2～7．4。分装于15ml试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／cm2灭菌20min.

l抗菌素：

氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。

五、仪器：

恒温振荡器。

低温冰箱-20℃

真空泵。

台式高速离心机

六、说明

1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐

等。

2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；作中的EDTA是二价离子

Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

3、TENS中NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定，怛当pH大于12或小于3 时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，因而使染色体DNA与质粒DNA变性。

TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合

成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核

糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用Rnase去除RNA时)受干扰。