RT-PCR的实验原理与操作步骤

合集下载

rt-pcr检测基因表达水平的原理

rt-pcr检测基因表达水平的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测基因表达水平。

其原理是通过逆转录将RNA转化为cDNA，并利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的序列，最终定量检测目标基因的表达水平。

下面将详细介绍RT-PCR的原理。

1.逆转录（Reverse Transcription）逆转录是RT-PCR的第一步，主要是将目标基因的RNA转化为互补的DNA，即cDNA。

逆转录反应需要逆转录酶（Reverse Transcriptase）和引物（Primers）的参与。

首先，待检测的RNA通过加热来解旋成为单链。

然后，在逆转录反应中，引物（Primers）结合在RNA的末端，提供一个起始点。

逆转录酶（Reverse Transcriptase）将引物作为模板，合成互补的DNA链。

引物一般选择Oligo-dT引物，它可以与RNA的多聚腺苷酸尾端结合，从而引导逆转录酶合成cDNA链。

此外，逆转录反应还需要dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液等辅助物资。

2. PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）逆转录后得到的cDNA是目标基因的复制物。

为了增加检测敏感性，需进一步扩增cDNA序列。

在PCR扩增过程中，引物（Primers）的作用是选择目标基因的特异序列，通过引物与目标序列的互补配对，使DNA聚合酶（DNA Polymerase）能够在相应的温度下在该位置合成新的DNA链。

PCR扩增需要参与的物质有DNA聚合酶、引物、dNTP、缓冲液和模板DNA。

引物是PCR反应中的关键，其中一对引物的设计应使其能够选择性地与目标基因序列的两个位点互补，从而能够在接下来的扩增反应中产生目标DNA片段。

PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。

首先，通过高温（通常为94℃至96℃）变性步骤将目标DNA链分离为两个单链。

RT–PCR的原理及实验步骤

RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。

原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。

因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。

GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。

rt-pcr反应步骤

rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。

它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。

以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。

这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。

2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。

3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。

引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。

4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。

在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。

在退火步骤中，引物与目标DNA结合。

在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。

这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。

5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。

总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。

rt-pcr的步骤和注意事项

RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。

下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。

步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。

常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。

2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。

逆转录反应需要逆转录酶和引物。

在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。

3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。

退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。

4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。

PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。

PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。

5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。

注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。

为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。

2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。

阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。

质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。

3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。

引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。

此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。

4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。

反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。

RT-PCR实验原理与步骤

RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。

【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。

4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。

【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。

延伸时间因目的序列长度不同而不同。

cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。

2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。

3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。

5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。

rt pcr原理

rt pcr原理RT-PCR原理RT-PCR是一种广泛应用于分子生物学和医学诊断领域的实验技术，其全称为反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）。

本文将详细介绍RT-PCR的原理。

一、反转录（Reverse Transcription）1. 反转录的概念反转录是指将RNA模板上的信息逆向转录成为DNA序列。

在RT-PCR中，反转录是制备cDNA（complementary DNA）模板的关键步骤。

cDNA是由RNA模板逆向合成的双链DNA，它可以作为PCR 扩增的模板。

2. 反转录过程反转录过程由三个主要部分组成：RNA逆向转录、RNA降解、cDNA 合成。

首先，需要使用反转录酶将RNA模板逆向转录为单链cDNA；然后通过碱基切除和填充，将单链cDNA变为双链cDNA；最后使用RNase H或其他酶降解RNA模板，得到纯净的cDNA。

二、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）1. PCR的概念聚合酶链式反应是一种体外扩增核酸序列的技术。

它可以在短时间内从微量样品中扩增出大量特定的DNA序列。

2. PCR过程PCR过程由三个主要步骤组成：变性、退火、延伸。

首先，将DNA 双链分离为两条单链，即变性；然后引入引物（primers），使其与目标序列的两端互相补合，形成一个模板-引物复合体；最后，使用DNA聚合酶在引物的作用下延伸新链。

三、RT-PCR原理1. RT-PCR的概念RT-PCR是一种结合反转录和聚合酶链式反应技术的方法，用于从RNA模板中扩增特定的DNA序列。

它可以将RNA转录为cDNA，并通过PCR扩增cDNA。

2. RT-PCR过程RT-PCR过程由四个主要步骤组成：反转录、初步扩增、二次扩增、检测。

首先进行反转录反应，将RNA逆向转录为cDNA；然后进行初步扩增，使用特定引物扩增目标序列；接着进行二次扩增，使用内部引物对初步扩增产物进行进一步扩增；最后进行检测，确定是否存在目标序列。

RTpcr技术的原理

RTpcr技术的原理RTpcr技术（逆转录聚合酶链反应技术），是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理和逆转录酶（reverse transcriptase）的技术。

逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成相应的DNA。

这项技术在分子生物学和生物医学研究中广泛应用，特别用于病原体检测、基因表达研究和疾病诊断。

1. RTpcr技术的基本原理RTpcr技术的基本原理是先利用逆转录酶将目标RNA转录成cDNA（亦称为反转录，即逆转录），然后以cDNA作为模板进行PCR扩增。

整个过程分为两个关键步骤：逆转录和PCR反应。

2. 逆转录过程逆转录过程是RTpcr技术的第一步，其目的是将RNA转录成cDNA。

逆转录酶是这一步的关键酶类，它能够将RNA作为模板，并合成相应的cDNA。

常用的逆转录酶有AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶和Tth逆转录酶等。

逆转录过程包括以下步骤：1.首先，逆转录酶结合到引物上，在低温下发生结合反应，形成逆转录酶-引物复合物。

2.然后，复合物结合到RNA模板上，在合适的反应条件下，逆转录酶开始合成新的cDNA链。

3.在合成过程中，逆转录酶通过酶的核酸酶活性，将RNA模板逐渐降解，最终产生单链cDNA。

4.最后，通过加热反应停止并灭活逆转录酶。

3. PCR反应过程PCR反应是RTpcr技术的第二步，其目的是扩增cDNA。

PCR反应是通过三步循环反应不断倍增DNA，使其产生指数级的增加。

PCR反应包括以下步骤：1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开为两根单链。

2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物结合的温度，引物与目标序列互补结合。

3.Extension（延伸）：将反应体系温度升高至逆转录酶的最适温度，逆转录酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。

以上三个步骤循环进行，每个循环使DNA序列倍增一倍。

通过适当的循环次数，可以将最初微小的DNA片段扩增至足够数量。

RT-PCR实验

1.PCR反应基本步骤
（1）变性：高温使双链 DNA解离形成单链（94℃，30s）（2）退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55-60℃，30s）（3）延伸：中温延伸。 DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（72℃，60s)
2.PCR体系
上游引物下游引物模板cDNA dNTP Taq酶(final) 0.5ul 0.5ul 0.5ul 1ul 0.5ul
(2)电泳跑胶：琼脂糖溶液凝固后，拔出梳子，放入到电泳槽中（电泳槽中有缓冲液），取 5ul的RNA样品加入1ul的loading buffer，用枪头吹打混匀，然后加入到凝胶上做好的加样孔中。将电泳槽连接到电泳仪的正负极，启动开始电泳。（ RNA电泳的电压200v，10 分钟左右，方向负极到正极）
RT-PCR实验总结
RT-PCR是从RNA中扩增目的DNA的技术，其步骤是将RNA逆转录成cDNA，再以此cDNA为模板进行 PCR。
一.组织RNA提取二.逆转录（RT）三.PCR
1.操作步骤：（1）将100mg左右组织放入研钵中，加液氮将组织研磨成粉末状，然后加1ml的Trizol（有毒，切勿沾到皮肤上），继续加液氮，研磨成粉末状，然后将粉末导入到离心管中，冰上5min。（2）往离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀，冰上5min。（3）4℃，12000g离心 15min（冰冻离心机），取上清液移入新的离心管中（切勿吸入离心管下层的沉淀），然后往新管中加入等体积的异丙醇，轻微混匀，冰上10min。
（3）评价RNA提取纯度的方法跑胶结束后，在紫外透射分析仪中观察到三条条带，最靠近加样孔的是28s,然后依次是18s,5s 的条带。是否降解 a b 纯度 a b c 条带宽窄有无拖尾现象加样孔有无条带 28s：18s ≧2 5s条带不太亮

rtpcr步骤及原理

rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。

本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。

同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。

引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。

反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。

一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。

这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。

反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。

反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。

RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。

引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。

二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。

PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。

PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。

PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。

每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。

变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。

三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。

凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。

RT-PCR详细图文解析

一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

RT-PCR操作步骤

RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

rtpcr的原理实验步骤及应用

RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。

本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。

原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。

RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。

在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。

2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。

PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。

3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。

4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。

5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。

通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。

实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。

提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。

2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。

需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。

按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。

反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

1．随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。三、试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤丌一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法实验材料
组织或细胞样品试剂、试剂盒

RT-PCR实验步骤

(1)RNA提取1、取出新鲜肝组织，放在液氮中冻存备用。

2、取匀浆器，加入lml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

3、取100mg新鲜肝组织，加入到匀浆器中。

4、充分研磨直至无可见组织块，转移到1.5ml EP管中。

(2)两相分离每lml的Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4C下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的Trizol Reagent试剂的60％。

(3)RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

(4)RNA清洗移去上清液，每lml Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入至少lml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC H2O配制)，清洗RNA沉淀。

混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。

(5)RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

(6)溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40u1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。

(7)测定RNA的质量1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定：A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。

样品RNA浓度(ug/m1)计算公式为：A260×稀释倍数×40 ug／ml。

具体计算如下：RNA溶于4u1 DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5ul用来测量以后，剩余样品RNA 为35u1，剩余RNA总量为：35u1×0.84 ug/ul=29.4 ug②纯度测定：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

RTPCR的实验原理与操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。

(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。

2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。

由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。

rt-pcr原理

rt-pcr原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的核酸检测技术，广泛应用于病毒检测、基因表达分析等领域。

本文将介绍RT-PCR的原理及其在实验室中的应用。

RT-PCR的原理主要包括逆转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）两个步骤。

首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。

在这一步骤中，首先需要一种特殊的酶——逆转录酶，它能够将RNA模板上的信息转录成相应的cDNA。

逆转录过程中需要一段RNA引物（primer）作为起始序列，使逆转录酶能够在该位置开始合成cDNA链。

经过逆转录反应后，RNA被转录成了cDNA，为后续的PCR反应提供了模板。

接下来是聚合酶链式反应，即利用DNA聚合酶在适当的温度下，将cDNA模板进行扩增。

PCR反应需要两段DNA引物，它们分别位于所需扩增片段的起始和终止位置。

在PCR反应的循环中，先是将DNA双链解旋，然后引物与模板结合，随后DNA聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。

通过多次循环，可以在较短的时间内扩增出大量的目标DNA片段。

RT-PCR技术具有高灵敏度和高特异性的特点，适用于检测病毒、细菌等微生物的核酸。

在病毒检测中，RT-PCR能够对病毒RNA进行逆转录合成cDNA，然后通过PCR反应扩增出目标病毒基因片段，从而实现对病毒的快速检测。

此外，RT-PCR还可以用于分析基因的表达水平，通过检测特定基因的mRNA水平，可以了解该基因在不同组织、不同生理状态下的表达情况，为基因功能研究提供重要信息。

除了基本的RT-PCR技术外，还有一些衍生技术，如实时荧光定量PCR （qPCR）。

qPCR在PCR反应中加入荧光探针，可以实时监测PCR产物的扩增过程，从而获得准确的定量信息。

这种技术在基因表达分析、病毒定量检测等领域有着广泛的应用。

rt-pcr的原理实验步骤及应用

RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。

下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。

逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。

•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。

引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。

•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。

2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。

•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。

2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。

•混合反应液，然后进行逆转录反应。

此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。

2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。

•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。

•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。

PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。

2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。

•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。

•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。

3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。

rtpcr的常用方法

rtpcr的常用方法一、RT-PCR的基本原理1. 逆转录反应（Reverse Transcription, RT）：RT-PCR的第一步是将RNA转录成互补的DNA，这一步叫做逆转录反应。

逆转录反应通过引入RNA逆转录酶（Reverse Transcriptase）和随机引物（Random Primers），将RNA模板转录成cDNA（反转录DNA）。

2. 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）：逆转录完成后，所得的cDNA经过稀释和变性等预处理后，使用DNA聚合酶（DNA Polymerase）和两个特异性引物，通过多轮的循环反应来扩增目标DNA区域。

二、RT-PCR的基本步骤1.RNA提取和纯化：从样品中提取并纯化RNA，以保证所得的RNA具有较高的纯度和完整性。

2.反转录反应：将RNA转录成cDNA，这一步可通过两种方式进行：使用随机引物、dNTPs、逆转录酶等直接反转录，或通过特异性引物（即RT引物）进行引物延伸。

3. PCR扩增反应：将逆转录所得的cDNA作为模板，使用特异性引物和DNA聚合酶进行DNA扩增。

PCR的循环条件通常是：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。

4.电泳分析：将PCR产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过对比分子量标准品，判断扩增产物的大小。

三、RT-PCR的优点和局限性1.优点(1)可以从一个RNA样本中扩增目标序列，从而可以检测低丰度的mRNA。

(2)推导出目标基因的相对表达量和定量结果。

(3)能够对基因表达的动态变化进行实时监测。

(4)扩增模板的选择性强，通过控制引物的设计，能够选择性地扩增特定的目标。

2.局限性(1)需要对RNA进行提取和纯化，这一步骤可能会引入一定程度的变异，影响结果。

(2)逆转录过程中可能发生评性引物引起的“板块效应”，导致不同通量的逆转录效率不同。

rtpcr操作流程

rtpcr操作流程RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。

下面将介绍RT-PCR的操作流程。

首先，准备实验所需的试剂和设备，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。

确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。

第二步是提取RNA样本。

将待检测的样本（如血液、组织等）加入RNA提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。

提取后的RNA样本应该是纯净的，没有受到污染。

第三步是逆转录反应。

将提取得到的RNA样本加入逆转录试剂盒中，进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。

逆转录反应的条件和时间根据试剂盒的说明进行设置。

第四步是PCR扩增。

将逆转录反应得到的cDNA加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。

PCR扩增的条件包括温度、时间和引物浓度等，需要根据试剂盒的说明进行设置。

第五步是检测PCR产物。

将PCR扩增反应得到的产物进行凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测，确定目标基因是否存在。

通过比对标准曲线或者与阳性对照样本进行比较，可以确定目标基因的表达水平。

最后，分析结果并进行数据处理。

根据PCR检测结果，可以判断样本中是否存在目标基因，以及其表达水平。

对数据进行统计分析，得出结论并撰写实验报告。

总的来说，RT-PCR操作流程包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、检测PCR产物和数据处理等步骤。

正确操作每一步，严格控制实验条件，可以确保实验结果的准确性和可靠性。

RT-PCR技术在医学、生物学等领域有着广泛的应用，对于疾病的诊断和研究具有重要意义。