香烟毒性对蚕豆根尖细胞微核的影响

香烟毒性对蚕豆根尖细胞微核的影响

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前言：中国是世界上最大的烟草生产和消费国，据统计，目前中国约有3.5亿烟民，并且仍然以每年300万人的速度激增，初始吸烟年龄趋于低龄化，每年将近有百万人死于由吸烟引起的疾病。[1]香烟中含有害物质有3000多种，致癌物质30余种，比如我们所熟知的尼古丁和焦油，香烟毒性能很大程度上促成细胞癌变，诱发癌症的产生，尤其是肺癌产生与吸烟的关系十分密切[2],吸烟时间越长，次数越多，开始吸烟的年龄越小，其毒性对人体的危害越大,有研究表明吸烟者比不吸烟者的患肺癌的几率高7-20倍[3-4]。目前国内对香烟毒性的研究较少，主要研究方向为快速检测方法[5-6]和体外细胞毒试验（中性红法）[7]来检测香烟毒性。而尚未发现从毒性使细胞产生微核的角度对香烟对其研究。所以笔者试图从不同浓度的香烟浸出液对微核产生数目的影响这一角度进行实验，进一步阐发香烟对人健康带来的严重危害，给世人起到警示作用。进行该实验需要注意以下几个问题：1、香烟中主要有害物质及其毒性的查明；2、香烟浸出的时间的掌控；3、香烟浸出液浓度梯度的设定；

4、学习培养蚕豆的方法；

5、掌握观察微核的方法。

实验材料：

1、受体材料：蚕豆。

2、诱导材料：市售红金龙牌香烟（市场价3元）。

3、试剂：固定液，解离液，95%酒精，85%酒精，75%酒精，70%酒精，醋酸洋红染液，蒸馏水。

4、器具：烧杯，培养皿，纱布，显微镜，恒温培养箱，计数器。

方案设计：

对照组：用蒸馏水培养4小时的蚕豆根尖。

实验组：用低毒组，中毒组，高毒组的香烟浸出液培养的4小时的蚕豆根尖。

具体实验步骤如下：

1、制得香烟浸出液。取3只锥形瓶，分别标记“低毒组”“中毒组”“高度组”，在里面依次放入1根，2根，3根香烟，再向其中倒入100ml蒸馏水，使有毒物质溶出，浸制时间大约为2小时，收集这三中不同浓度的香烟浸出液。

2、蚕豆根尖的制备和处理。首先将蚕豆用蒸馏水浸泡24小时，使种皮松软后放入垫有白纱布的培养皿中，在上方也盖上2层湿纱布，置于25℃的恒温培养箱中培养，每天换蒸馏水1次，待根尖长至2-3cm时，即可用于实验。将准备好的蚕豆用蒸馏水冲洗干净后，均分为4组。第一组为对照组，

用20ml蒸馏水培养，其余三组分别为低毒组，中毒组，高毒组，用前面得到的等量的香烟浸出液进行培养。培养时间均为4h，培养温度为25℃。然后用自来水清洗，再在25℃蒸馏水中浸根恢复培养24h，切1cm左右的蚕豆根尖于固定液中固定24h，之后分别用95%、85%、75%乙醇处理10min，最后置于70%乙醇中保存待测[8]。

3、微核观察。在每个培养皿中随机选取3个蚕豆根尖，将其放在1mol/L的HCl解离液中解离5min。用蒸馏水清洗3次，将解离液洗去，用刀片或解剖针截取根尖部分，滴上少许染液，染色15min，再盖上盖玻片，轻轻捣碎组织，在显微镜下观察细胞的分生组织区计数1000个细胞，然后测定其微核千分率（MCN,‰）和抑制率（%）。具体计算公式为

MCN(‰)＝(含微核的细胞数)/(观察的细胞数)*1000

抑制率（%）＝（对照组含微核细胞数-实验组含微核细胞数）/（对照组含微核细胞数）*100[8-10]

数据处理表格设计

表-1 微核试验原始数据记录表

对照组低毒组中毒组高毒组

观测细胞数（个）

含微核细胞数（个）

MNC(‰)

抑制率（%）

参考文献：

[1]李竹，姜垣.烟盒上健康警语及其在控烟中的作用[J].中国慢性病预防与控制，2006,14（5）:380.

[2]Shiekls PG.Molecular epidem iology of smoking and lung canser [J]. Oncogene, 2002, 21: 6870-6876.

[3]廖美琳.嗜烟与致癌并非危言耸听[J].肿瘤预防诊疗与康复指南，2002,15(2):4.

[4]Pet R. Darby S, Deo H,et al.Smoking ,smoking cessation,and lung cancer in the UK since 1950:combination of national statistics with two case-control studies [J]. BMJ, 2000, 3:321-329.

[5]孙波，张桂荣等.100种香烟快速检测及毒性分析[J].中国初级卫生保健，2007,21（10）：69-70.

[6]王世平，孙波等.香烟毒性快速检测及毒性分级的方法研究[R].中国毒理学会第五次全国学术大会论文集,2010.

[7]张桂荣，王世平等.细胞毒试验对香烟毒性检测的研究[J].中国卫生工程学，2010,9（6）：406-410.

[8]朱蕴兰，邵颖等.蛹虫草多糖对紫外线诱发蚕豆根尖细胞微核的影响[J]. 商品科学，2009,30（1）：177-180.

[9]李宏.土壤农药残留物对蚕豆根尖细胞微核及染色体畸变的影响[J].贵州农业科学，2009，37（4）：182-183.

[10]朱睦元王君辉.现代遗传学实验[M]浙江；浙江大学出版社，2009:95-96.