琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制 性片段长度多态性分析、基因突变检测等 。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、 单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测 序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题 与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致 条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带 拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条 带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高， 导致DNA在凝胶中扩散。
琼脂糖凝胶电泳-完 整整理
目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝 胶中进行的电泳技术，主要用于 分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同 样品中目标DNA片段的浓 度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪 音的比例，评估DNA片段 的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶的特点
（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合 物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定 6.有热可逆性
（三）结 构 特 征
CM 甘油三脂 胆固醇 蛋白质 带电量（Q） pH8.6为例 颗粒大小（mm） 密度 电泳速度 形态 多 多 少 少 大 低 慢 规则 不规则 VLDL LDL HDL 少 少 多 多 小 高 快
pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电 泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力 小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL 跑在前。
2. 按超速离心法分 乳糜微粒(chylomicron,CM) ( < 0.96 ) 极低密度脂蛋白 (0.961.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.0061.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) 低密度脂蛋白LDL(1.0191.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.0631.21) (high density lipoprotein, HDL)
脂 蛋 白
血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE
甘油三酯 （TG） 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 1. 按电泳法分 乳糜微粒（chylomicron,CM） -脂蛋白 （-位） 前-脂蛋白（2-位）） -脂蛋白 （1-位）
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性DNA分子大小（kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
二、仪器设备及材料
1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V， 电流可变范围0～250～500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个 波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色 有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。
3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶
床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床 两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中， 并使样品孔位于电场负极。 5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越 过凝胶表面1～2mm为宜。 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现 有气泡，应设法去除。 7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积 1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。
8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影记录； ③凝胶成像分析系统处理。
溴化乙锭缺点：
EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。 注意：①操作中务必带上防护用手套。 ②如不慎皮肤与溶液接触，应立即用清水彻底冲洗。 ③含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其 致诱变活性下降为原来的1/200左右，方可丢弃。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳1.原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具备网络结构，物质分子通过时会受阻力，大分子物质在汹涌时受的阻力小，因此在凝胶电泳中，磁铁颗粒的拆分不仅依赖于天量电荷的性质和数量，而且还依赖于分子大小，这就大大提高了辨别能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广为应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据ph不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的ph在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的dna片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离dna的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的dna片段。
dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时存有电荷效应和分子筛效应。
dna分子在低于等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向负极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具备等量的净电荷，因此它们能够以同样的速率向负极方向移动。
2操作方式流程准备干净的配胶板和电泳槽琼脂糖凝胶电泳：水平电泳注意dna酶污染的仪器可能会降解dna，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
(1)电泳方法1一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大dna链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的dna链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
(2)凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用以展开大片段核酸的电泳，高浓度的用以展开大片段分析。
低浓度胶坚硬，小心操作方式和采用质量不好的琼脂糖就是解决办法。
琼脂糖凝胶电泳
二、实验方法
• 1．50×TAE的稀释：如 制备50mL 1×TAE，取 1mL 50×TAE加入 49mL水定容至50mL。
• 2．制备1%的琼脂糖胶 液：取0.2g琼脂糖溶于 20mL TAE中，在短时间 里加热琼脂糖全部熔化， 使溶液冷却至60℃.(加入 浓度为10mg/mL的EB 2μL，使EB的终浓度为 1μg/mL)。
• 3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用 乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后 用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。
• 4．用胶带封住胶床，放好梳子。
Hale Waihona Puke • 5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间， 凝固20—60min。
• 6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽 内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。
Thanks
农药学
贮存温度 4℃
室温
4℃
4℃ 4℃
• 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入 样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作 更为便利。
• 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的 2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖 凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
• 7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面 1cm。
• 8．分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品 加入加样孔。
• 9．正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为 50mA。
• 10．电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。
三、注意事项与实验技巧
琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。
一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。
二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。
一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。
F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。
由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。
此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。
当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。
根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。
该公式指球形颗粒所受的阻力。
代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。
带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。
在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。
它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。
影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。
deae琼脂糖凝胶 电泳
deae琼脂糖凝胶电泳
DEAE琼脂糖凝胶电泳是一种常用的离子交换层析技术，用于分离和纯化带有不同电荷的生物大分子（如蛋白质和核酸）。
下面是该技术的基本原理和步骤：
1. DEAE琼脂糖：DEAE（二乙氨乙基）琼脂糖是一种具有阳离子交换性质的树脂。
它可以与带有负电荷的生物大分子发生静电相互作用。
2. 样品加载：首先将待分离的样品加载到经过预处理的DEAE琼脂糖凝胶柱中。
样品中带有负电荷的生物大分子会被DEAE树脂吸附。
3. 洗脱：通过以逐渐增加浓度或pH值的缓冲溶液，洗脱在DEAE琼脂糖上吸附的目标生物大分子。
这样，不同带电性质的生物大分子就可以被分离开来。
4. 收集分馏：根据样品中目标生物大分子的特点和需求，收集分离出的纯化目标物。
DEAE琼脂糖凝胶电泳是一种常见且有效的离子交换技术，广泛应用于生物化学、分子生物学和生物医学研究中。
它可以实
现对生物大分子的分离和纯化，有助于深入了解生物分子的结构和功能。
琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳
琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳1. 什么是琼脂凝胶电泳？大家好，今天我们来聊聊一个科学小话题——琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。
听起来有点复杂，其实它就像是科学界的“选美比赛”，不过选的不是小姐姐，而是分子哦！这两个小家伙都是用于分离和分析生物分子的方法，主要在基因和蛋白质的研究中大显身手。
琼脂凝胶电泳是用琼脂凝胶来分离生物大分子，比如DNA、RNA和蛋白质；而琼脂糖凝胶电泳则是用琼脂糖，专门用于DNA的分析。
听起来是不是有点像“同门兄弟”的感觉呢？1.1 琼脂凝胶电泳的工作原理琼脂凝胶电泳的原理其实很简单。
想象一下，一条河流，河水流动，河里的石头和沙子各自沉浮。
琼脂凝胶就像这条河，而DNA分子就像在河里漂浮的小石头。
电流流过时，带电的分子在电场的作用下开始移动，移动的速度和距离就取决于它们的大小和形状。
小分子跑得快，大分子跑得慢，最终在凝胶里形成不同的位置，像极了学校运动会上那场激烈的接力赛。
1.2 琼脂糖凝胶电泳的应用而琼脂糖凝胶电泳主要是针对DNA的。
因为DNA分子比较大，所以我们需要用琼脂糖来制造凝胶。
这个过程可不简单，首先得把琼脂糖溶解，然后倒入模具里，等它凝固。
接着，咱们就可以把样品放进去，通电后就能观察到DNA分子的分离了。
这就像在举行一场大聚会，大家按身高、体重分组，最后排成一条长龙，看看谁的身形最抢眼！2. 准备工作与步骤当然，做电泳可不是随便搞搞就完事的。
咱们得先做好准备工作。
首先要准备好琼脂和琼脂糖，根据实验需求调配浓度，这就像做饭调味一样，浓度太高，分子跑不动；浓度太低，又不够清晰，真是个“难兄难弟”。
然后，得把样品和缓冲液混合，搅拌均匀，这一步就像调色板，颜色调和得越好，最后的效果才越惊艳！2.1 凝胶的制备接下来，咱们需要制作凝胶。
把琼脂和琼脂糖加热至完全溶解，然后迅速倒入模具，待其凝固。
这个过程就像等待美食出炉一样，既期待又有点小紧张。
凝固后，再在凝胶上打个小洞，放入样品，别忘了在样品的旁边加上分子量标准，这样最后才能评比，看看谁最出色。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种凝胶电泳方法，用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学，以分离琼脂糖基质中的大分子混合群，例如DNA、RNA 或蛋白质。
琼脂糖是从海藻中提取的天然线性聚合物，当在缓冲液中加热并冷却时，通过氢键形成凝胶基质。
它们是分离中、大型核酸最常用的介质，分离范围广。
琼脂糖凝胶电泳实验常用以DNA 切胶回收，DNA 分离和用于佐证DNA 是否重组、质粒等是否切开。
今天我们就来聊聊琼脂糖凝胶电泳实验的一些小技巧小细节。
第一步：胶液的制备称取0.4g 琼脂糖，置于200ml 锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热，直到琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。
总液体量不宜超过锥瓶的50%容量。
否则会溢出来的。
毛博就吃过这个亏。
还要擦洗微波炉。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
第二步：胶板的制备倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀。
东一块西一块的。
果冻做出来就不好看啦。
速度也不可太快，否则容易出现气泡。
果冻做出来里面都是气泡。
怎么吃呀？待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。
第三步：加样注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
果冻下面被戳个窟窿，还怎么吃呀？第四步：电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。
第五步：染色未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。
第六步：观察和拍照在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。
DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
除这些细节之外，还有一些注意事项：1. 酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
琼脂糖凝胶电泳详解
一、简介琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质、利用核酸分子在电场中时的电荷效应和琼脂凝胶的分子筛效应，达到分离核酸混合物的一种电泳技术。
1、琼脂糖的分子筛效应1）琼脂糖（Agarose）来源于海洋红藻细胞壁，是一种大分子线性聚合物，基本结构是由D-半乳糖和3,6-anhydro-α-L-半乳糖通过β-1,4糖苷键结合而成的双糖单位在α-1,3糖苷键的连接下形成的一个长链。
琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。
常用作电泳、层析等技术中的半固体支持物，用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。
琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到40℃左右形成良好的半固体状凝胶。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成直径从50nm-200nm不等的孔径结构，孔径的大小由凝胶浓度控制。
琼脂糖凝胶中孔径的大小，影响了通过的核酸分子的大小以及通过的速度。
通常来说，琼脂糖凝胶的浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小，迁移速度也越慢。
DNA片段越小，所需的胶浓度越大；而DNA 片段越长，所需的胶浓度则越小。
选择合适的胶浓度才能更好的分离片段。
2）琼脂的质量评价琼脂糖通常通过其凝胶强度和电内渗情况判断质量好坏。
强度越高，凝胶性能越好。
质量较好的琼脂糖强度通常在1200g/cm2以上，硫酸根含量在0.2%以下，电内渗在0.13以下。
琼脂糖是从琼脂中分离而来的。
琼脂由琼脂糖和琼脂果胶组成的，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物，和琼脂糖结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。
在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，附着到琼脂糖的多糖基质上，造成电内渗（EEO）。
电内渗会导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向负极移动，从而造成与DNA反方向迁移的液流，使DNA的分离效果变差。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂是一种多糖，主要由琼脂糖（约80%）和琼脂凝集素组成。
琼脂糖是一种中性物质，由半乳糖及其衍生物组成，不带电荷，而琼脂凝胶是一种含有硫酸盐和羧基的强酸性多糖。
因为这些基团是带电的，所以它们在电场的作用下能产生强烈的电渗作用。
此外，硫酸盐能与一些蛋清物质相互作用，影响电泳速度和分离效果。
因此，目前平板电泳常用琼脂糖作为电泳载体，其优点如下。
1.琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品无需预先处理即可电泳。
2.琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
3.琼脂糖透明，无紫外线吸收。
电泳过程和结果可直接用紫外灯检测和定量测定。
4.电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。
制成干膜可长期保存。
目前，琼脂糖常用作分离蛋白质和同工酶的电泳载体。
琼脂糖电泳和免疫化学的结合已经发展成为免疫电泳技术，它可以识别其他方法无法识别的复杂系统。
由于超微技术的建立，可以检测到0.1ug蛋白质。
琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如dna鉴定，dna限制性内切核酸酶图谱制作等。
由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。
二、dna的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离核酸主要基于它们的相对分子质量和分子构型，并且与凝胶浓度密切相关。
1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系①dna分子的大小在凝胶中，dna片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当dna分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离dna时，分子大小不宜超过此值。
2.琼脂糖浓度如下表所示。
不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶分离。
琼脂糖凝胶电泳法
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
琼脂糖凝胶电泳法
1.琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
2.胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至45-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
琼脂糖凝胶电泳实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中常用的技术之一，其目的主要包括以下几个方面：1、分离和鉴定 DNA 片段：通过电泳可以将不同大小的 DNA 片段在琼脂糖凝胶中按照分子量大小进行分离，从而能够直观地观察到DNA 样品的组成和纯度。
2、检测 DNA 的质量：通过观察电泳图谱中 DNA 条带的亮度、清晰度和完整性，可以评估 DNA 样品的质量，判断是否存在降解、杂质污染等情况。
3、定量分析 DNA 浓度：结合已知浓度的 DNA 标准品，通过比较样品条带与标准品条带的亮度，可以对 DNA 样品的浓度进行大致的估算。
二、实验原理琼脂糖是一种从海藻中提取的线性多糖聚合物。
当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，会形成网状的凝胶结构。
由于琼脂糖凝胶具有分子筛效应，DNA 分子在电场中会向正极移动，其迁移速度取决于 DNA 分子的大小和构象。
较小的 DNA 分子在凝胶中受到的阻力较小，迁移速度较快；较大的 DNA 分子受到的阻力较大，迁移速度较慢。
因此，不同大小的 DNA 分子在琼脂糖凝胶中会被分离成不同的条带。
在电泳过程中，通常使用溴化乙锭（EB）等荧光染料对 DNA 进行染色。
EB 能嵌入DNA 分子的碱基对之间，在紫外线照射下发出荧光，从而使 DNA 条带得以显现。
三、实验材料与设备1、实验材料DNA 样品：本次实验使用的是经过提取和纯化的λDNA 样品。
琼脂糖：选用高纯度的琼脂糖粉末。
电泳缓冲液：5×TBE 缓冲液（Tris硼酸EDTA），使用时稀释至1×TBE 工作液。
上样缓冲液（Loading Buffer）：含有甘油、溴酚蓝等成分，用于增加样品密度，便于样品沉入加样孔，并指示电泳进程。
核酸染料：溴化乙锭（EB）溶液。
2、实验设备电泳仪：提供稳定的直流电源，用于产生电场。
水平电泳槽：放置琼脂糖凝胶，容纳电泳缓冲液。
凝胶成像系统：用于观察和拍摄电泳结果。
琼脂糖凝胶电泳和SDSPAGE凝胶电泳
02
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖凝胶电泳基于DNA分子在电场中的迁移率不同进行分离。DNA分 子在琼脂糖凝胶中通过电泳分离，其迁移率取决于其大小、构象和所带 电荷。
琼脂糖凝胶具有网络结构，DNA分子在电场作用下通过时受到阻力，迁 移速度与DNA分子的大小和构象有关。
DNA分子在琼脂糖凝胶中迁移时，会受到凝胶孔径和电场强度的影响， 孔径越小，对小分子DNA的阻滞越强，电场强度越高，DNA分子的迁移 速度越快。
适用范围比较
琼脂糖凝胶电泳
适用于DNA的分离和纯化，常用于基因克隆、测序和分子生物学研究。
SDS-PAGE凝胶电泳
适用于蛋白质的分离和纯化，常用于蛋白质的鉴定、纯化和分子生物学研究。
实验操作比较
琼脂糖凝胶电泳
操作相对简单，通常将DNA样品与染料混合后加入凝胶孔中，然后进行电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳
操作相对复杂，需要制备不同浓度的蛋白质样品，加入SDS和染料，然后进行电泳。此外，还需要注 意缓冲液的pH值和离子强度，以确保蛋白质的稳定性和分离效果。
05
结论
对两种电泳技术的总结
琼脂糖凝胶电泳
主要用于分离大分子DNA片段，操作简单，分辨率高，但不适合分离蛋白质。
SDS-PAGE凝胶电泳
主要用于分离蛋白质，通过电荷和分子量的差异分离蛋白质，分辨率高，但操作复杂。
缺点Байду номын сангаас
可能会引起蛋白质的变性，不能用于研究蛋白质的空间结构和功能。
04
琼脂糖凝胶电泳与SDSPAGE凝胶电泳的比较
分离效果比较
琼脂糖凝胶电泳
主要用于分离大分子DNA片段，如基因组DNA和质粒DNA 。其分离效果主要取决于DNA片段的大小和电荷量。
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为介质的一种电泳方法，其兼具“分子筛”和“电泳的双重作用。
琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的，当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于核酸片段的电泳检测。
琼脂糖凝胶电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法的可信度非常高。
琼脂糖凝胶电泳的原理荧光染料检测核酸的存在观察琼脂凝胶中核酸的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭(EB) 进行染色，所用的荧光染料含有一个可以嵌入核酸的堆积碱基之间的荧光基团，当染料与核酸结合后呈现荧光。
核酸吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被结合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来，因此，当凝胶中含有游离的EB时即可以检测到DNA和RNA的存在。
注1：由于EB具有很强的毒性，因此在操作时一定要戴手套，并且最好有专门的区域进行电泳检测实验。
注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的检测效果，同时毒性要低很多。
电泳区分核酸大小核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，琼脂糖凝胶电泳即根据这个原理对核酸进行区分。
核酸分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于核酸的戊糖-磷酸骨架在结构上具有重复性，长度相同的核酸链几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
此外，含有琼脂糖的凝胶具有网状结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在琼脂糖凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
琼脂糖凝胶电泳解析
D23-TA克隆酶切鉴定 1~3 阳性克隆 6~8 阳性克隆/EcoRI 4 假阳性克隆（载体环化） 9 假阳性克隆/EcoRI 5 DL2000
图4 S基因克隆到T载体中
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5.1kb 2000bp
1 PCDNA3/EcoR 1 酶切 2，3，7，8，9，10 PCD12/ EcoR 1 酶切 4,5 PCD12/ EcoR 1 酶切(酶切不全） 6 DL2000
1 Marker 2 S2（1875bp） 3 S1（2172bp）
2nd扩增S1，S2 1 S1 2 S2 3 DL2000
S1，S2产物纯化 1，4 DL2000 2 S1
3 S2
PCR扩增某病毒S基因
二、琼脂糖凝胶电泳的原理是什么
▪ 1 带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳 动。
▪ 2 电泳缓冲液中充满了离子，因而导电，DNA分子 在PH 7~8时带负电，因此在电场作用下向正极泳动。
3 上样，电泳，染色
加样：取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀，用微量移液 枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例 增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个 样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操 作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持 在60-80V（1～5v/cm），电流在40mA以上。当溴酚蓝 条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
①-2 ①-7 ①-8 ①-9 ①-10 ③-2 ③-5 ③-13 ⑥-13 ⑥-14 ⑥-16 ⑥-20 M
⑥-24 ⑦-1 ⑦-2 ⑦-4 ⑦-5 ⑦-6 ⑦-13 ⑦-14 ⑧-3 ⑧-4 ⑧-7 ⑧-8 M
实验三 琼脂糖凝胶电泳
三、实验材料
上次实验提取的质粒 pSK（3 kb） 和MP3 （6 kb）
关于质粒大小在电泳中的鉴定：酶切后线性化条带电泳时 所处的位置指示质粒的大小。
该质粒载体用的是pUC的复制子，拷 贝数能达到500-700个。
（三）电泳
打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动， 约一小时后即可观察。
（四）观察
将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯， 可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA
的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初
TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存； TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储
存，易产生沉淀；
分离大片段最好用TAE，小片段用TBE； TBE存在硼离子，会对一些酶的活性稍有影响。
常用6×凝胶加样缓冲液配方
有的10 × loading buffer中多了一样SDS（1%），它会使酶类（如Taq酶和限 制性内切酶）变性，有终止酶促反应的作用。但在电泳时（以PCR产物为 例），在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一 条带没有什么区别（大概1000 bp左右）。不加SDS的凝胶加样缓冲液只有 电泳指示剂和沉淀样品的作用。
注意：同样的marker点在不同的胶孔中，电泳迁移率有差异。因为电泳 时有边缘效应，边上的跑得快；跑胶时间长了会发热，整快胶受热不均 时也会出现这种现象。
碱裂解法抽提质粒电泳会出现几条带？
但因为抽提质粒时各人的操作差异,造成CCC/OC/L等多种构型， 条带多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三条：超螺旋、 开环和复制中间体。 如果RNaseA添加过少或者质量不高，会导致RNA降解不完全， 会有一条远离点样孔跑的最快的残余RNA条带；根据RNA降解 程度不同，条带亮度会有很大差异。 提取过程中加溶液震荡剧烈会导致基因组片段断裂成很小的 片段，因此质粒中含有基因组的短片段会导致一些电泳条带 的出现。 还有电泳时间的长短造成各条带的移动距离也不一，一般较 难判断是对是错。电泳跑的时间较短，尽管能分出大小，但 习惯上跑开点对分辨差别不大的条带有好处，短胶容易出现 误判。
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DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。
一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。
二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。
一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。
F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。
由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。
此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。
当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。
根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。
该公式指球形颗粒所受的阻力。
代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。
带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。
在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。
它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。
影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。
二、琼脂糖凝胶电泳通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。
用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。
这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。
此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。
一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。
不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。
具体见表格：琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb0.3 50---600.6 1----200.7 0.8---100.9 0.5---7.01.2 0.4----6.01.5 0.3---3.02.0 0.1---2.0琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液：缓冲液pH1.50mmol/L Tris-NaH2PO4-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.02.50mmol/L NaH2PO4- Na2HPO4-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.03.50mmol/L Tris-乙酸-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.04.50mmol/L 乙酸钠-乙酸-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.05.89mmol/L Tris-H3BO3-1--5mmol/L EDTA 8.3琼脂糖凝胶电泳常用的样品缓冲液(示踪染料)：0.25%溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-30%甘油水溶液，并且这两种指示剂在琼脂糖凝胶中的迁移率不同，可以指示一定片段长度的DNA迁移率(具体见下表)。
琼脂糖凝胶浓度溴酚蓝二甲苯青0.6% 1kb /1.0% 0.6kb 2kb1.4% 0.2kb 1.6kb2.0% 0.15kb /核酸分子量标准(Marker)：DNA电泳一定要用DNA Marker或者是已知大小的正对照DNA来估计片段的大小。
应该选择在目标片段大小附近Ladder 较密的Marker，这样对于目标片段大小的估计才比较准确。
核酸电泳染色剂：核酸电泳以后，需要经过染色才能显现带型，最常用的染色剂是溴化乙锭(EB)，其次是银染法。
1、溴化乙锭(ethidium bromide): 一种荧光染料，可以嵌入核酸的双链碱基对之间，在紫外光线的激发下，发出红色荧光。
2、银染法：染色液中的银离子可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使银离子还原成银颗粒，可以将核酸带染成黑色。
灵敏度比EB高，但是DNA不易回收。
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.琼脂糖凝胶电泳一,实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上.由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动.在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大小来使其分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,而构型不同的DNA分子.在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测.相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准.在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254～365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测.一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段.本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法.琼脂糖凝胶浓度（%）线状DNA分子分离范围（kb）0.35--600.61--200.90.5--71.20.4--61.50.2--32.00.1--2琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。
低熔点琼脂糖的熔点为62--65,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片断的回收、质粒与外源性DNA 的快速连接等。
DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度、DNA分子量及其构象、电泳缓冲液、电场强度等因素有关，一般说来，DNA片断越大或者琼脂糖浓度越大，其迁移速率越大；而电场强度越高，其迁移速率越大。
不同浓度琼脂糖凝胶DNA分离范围见上图表。
二,仪器及试剂1.仪器及耗材:水平电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统,微波炉,微量移液器,透明胶带,点样或parafilm,100 ml或250 ml锥形瓶,量筒,吸头等.2.试剂及配制:50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.高温高压灭菌,室温保存.1×TAE缓冲液的配制:称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶配制:100 ml称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油.配制:10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.其它试剂:DNA样品,DNA Ladder ,琼脂糖,三,操作步骤1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3.加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.四,常见问题及注意事项1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA 的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA > 线状DNA > ocDNA.添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.什么是琼脂糖电泳的？其基本知识及操作方法是什么？不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变？什么是琼脂糖电泳的？其基本知识及操作方法是什么？不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变？以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳。