(生物科技行业)CT法分析基因相对表达量
2–δδct公式原理
2–δδct公式原理
2-ΔΔCt（2-ΔΔCt method）是一种常用于基因表达分析的相对定量方法。
它是基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术的数据分析方法，用于比较不同样本之间的基因表达水平差异。
该公式的原理如下：
1. Ct值，Ct值是荧光定量PCR实验中，检测到荧光信号超过背景噪音的阈值周期数。
Ct值越小，说明目标基因的起始量越高。
2. ΔCt值，ΔCt值是相对表达量的计算，表示目标基因的Ct 值减去参考基因的Ct值。
参考基因通常是在不同样本中表达稳定的基因。
3. ΔΔCt值，ΔΔCt值是比较不同样本之间的基因表达水平差异的计算，表示目标样本的ΔCt值减去参考样本的ΔCt值。
ΔΔCt值越小，说明目标基因在目标样本中的表达水平相对较低。
4. 2-ΔΔCt值，2-ΔΔCt值是将ΔΔCt值转化为相对表达量的计算。
它表示目标样本的相对表达量相对于参考样本的相对表达
量的倍数。
如果2-ΔΔCt值为1，表示目标样本和参考样本的表达量相等；如果2-ΔΔCt值大于1，表示目标样本的表达量高于参考样本；如果2-ΔΔCt值小于1，表示目标样本的表达量低于参考样本。
通过使用2-ΔΔCt公式，可以相对定量地比较不同样本之间的基因表达水平差异，而不需要绝对定量的标准曲线。
这种方法在生物医学研究中广泛应用，特别是在基因表达调控、药物研发和疾病诊断等领域。
需要注意的是，2-ΔΔCt方法的前提是基因的放大效率在不同样本中是相似的，并且参考基因在各个样本中的表达稳定。
因此，在使用该方法时，选择合适的参考基因和进行合适的实验设计非常重要，以确保结果的准确性和可靠性。
利用实时定量 PCR技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异.pptx
X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量； △ C T 表示目标基因和内标基因 C T 值的差异（ C T,X -C T,R ） 整理上式得：
最后用任一样本 q 的 X N 除以参照因子（ calibrator ， cb ）的 X N 得到：
在这里 对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。 因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：
学海无 涯
利用实时定量 PCR 技术通过 2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异
Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen
Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy.
Washington State University, Washington 99164-6534 现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算 起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2 - △△ CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。本文介绍了该方法的推 导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种 2 - △△ CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时 定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
用实时 PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。 2 - △△ CT 方 法可用于定量 PCR 实验来计算基因表达的相对变化： 2 - △△ CT 公式的推导 , 以及实验设计，有效性 评估在 Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介绍。用 2 - △△ CT 方法分析基 因表达数据在文献中也有报道 (5, 6) 。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了 2 - △△ CT 两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中都可能被用到。
实时荧光基因相对表达数据处理△△CT
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理相对定量△CT 和2-△△CT方法一、实时荧光原理及其中的概念实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。
废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。
实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
qPCR中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，因此在PCR每个循环的延伸(双链图2)过程中检测荧光信号，可以绘制原始的扩增曲线。
如下图1：图1：PCR扩增曲线图2 ：双链发射荧光nR n荧光信号量，n为循环数扩增曲线可以分为：图31.基线期：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基线。
2. 对数期 ：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线3. 平台期 ：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP 的消耗殆尽,不会再有新的DNA 链产生了,就进入到平台期了实时荧光PCR 中重要的概念：CT 、扩增效率CT 值（Cycle threshold value ）：实时荧光PCR 过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。
起始模板DNA 量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct 值越小。
Log 模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
扩增效率E （efficiency ）：理想的PCR 反应在指数期应该是Rn=R 0 * 2n（Rn ，n 次循环产物量。
R 0，初始模板量。
荧光定量pcr 2-ct值统计方法
荧光定量pcr 2-ct值统计方法荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的PCR技术，已经广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域的分子遗传学研究中。
在qPCR实验中，常用的数据分析方法是2-CT值法（Delta-CT method）和标准曲线法（Standard curve method）。
本文将介绍2-CT 值法的统计方法及其应用。
1. 原理2-CT值法是一种基于CT值测定样品中目标基因表达水平的方法。
CT值指的是PCR循环数的阈值点，即当荧光信号强度到达一定程度时，PCR反应被认为已进入指数增长期。
CT值越低，表示目标基因的表达量越高。
实验中，通常以内参基因（如β-actin、GAPDH 等）作为对照，计算目标基因和内参基因的CT值差（Delta CT值，ΔCT），代表样品中目标基因的表达水平。
如下所示：ΔCT = CT（目标基因） - CT（内参基因）2. 统计方法使用2-CT值法，需要进行数据标准化、统计和图形展示。
2.1 数据标准化数据标准化是指将ΔCT值转换为相对表达量（Relative Quantification）或折叠变化（Fold Change），用于比较不同样品之间目标基因表达水平的差异。
相对表达量是一种无单位的值，其计算公式为：Relative Quantification = 2^-ΔCT其中，2为基数，-ΔCT表示将ΔCT值取相反数后再进行指数计算。
折叠变化是指样品中目标基因表达量的倍数差异。
其计算公式为：Fold Chang e = 2^ΔΔCT其中，ΔΔCT表示将两个样品的ΔCT值差（如对照组和实验组）做差。
（1）平均值和标准误差（Mean and Standard Error）：计算每组样品的相对表达量或折叠变化的平均值和标准误差，用于比较不同样品组之间的差异。
（2）t检验（t-test）：比较不同样品之间的平均值是否显著不同。
（4）基因表达热图（Heatmap）：根据每个样品的相对表达量或折叠变化进行聚类分析和热图展示。
2 -δδct 相对定量法
2 -δδct 相对定量法
2 -δδct相对定量法是一种常用的基因表达定量方法。
它使用实时荧光定量PCR（qPCR）技术来测量基因的表达水平，并相对于参考基因或对照样品进行比较分析。
在这种方法中，首先需要选择一个合适的参考基因，该基因应具有在实验条件下稳定的表达水平。
然后，通过qPCR测量感兴趣的基因和参考基因的Ct值（阈值循环数）。
Ct值是表示当荧光信号达到特定阈值时样品中的目标基因或参考基因的PCR循环数。
接下来，计算相对表达量的差异（2-ΔΔCt）。
ΔCt是目标基因Ct值减去参考基因的Ct值，表示目标基因与参考基因的相对表达水平差异。
2-ΔΔCt为ΔCt的对数转化，表示目标基因在不同样品之间的相对表达量差异。
通过使用2-δδct相对定量法，研究人员可以相对定量地比较不同样品中的基因表达水平，例如，在实验组与对照组之间比较基因表达差异。
这种方法广泛应用于生物医学研究和基因功能研究等领域。
相对定量方法PCR技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异
利用实时定量 PCR 技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异Kenneth J. Livak and Thomas D. SchmittgenDepartment of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy.Washington State University, Washington 99164-6534现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2 - △△ CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种 2 - △△ CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录 PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （ RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（ 1 － 3 ）。
实时 PCR 技术和 RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（ 4 ， 5 ）。
实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（ 6 － 9 ），包括已发表的两篇研究论文（ 10 ， 11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说 X 基因在经过某种处理后表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从 1000 拷贝 / 细胞增加到 2500 拷贝 / 细胞更加直观。
利用实时定量 PCR技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异新
参数优化和结果分析METHODS 25, 402–408 (2001)doi:10.1006/meth.2001.1262, available online at on利用实时定量PCR技术通过2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异Kenneth J. Livak and Thomas D. SchmittgenDepartment of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy.Washington State University, Washington 99164-6534现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2 - △△CT 方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种 2 - △△CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（ 1 －3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量PCR 技术（ 4 ，5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时PCR 进行绝对定量已有多篇报道（ 6 －9 ），包括已发表的两篇研究论文（10 ，11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
相对定量2 δct推导
相对定量2 δct推导1. 引言相对定量2（Relative Quantification 2）是一种常用的实验方法，用于测量基因表达水平的变化。
在相对定量2中，我们通过比较目标基因在不同条件下的表达水平来推断其相对变化。
δCt是一种常用的计算方法，用于比较两个样本之间的差异。
本文将详细介绍相对定量2和δCt推导的原理和步骤。
2. 相对定量2原理相对定量2是一种基于实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）技术的方法，通过测量目标基因和参考基因在样本中的拷贝数来确定其表达水平。
相对定量2与绝对定量方法不同之处在于，它并不直接测量目标基因的绝对拷贝数，而是将其与参考基因进行比较，从而得到一个相对值。
参考基因通常被认为在不同条件下的表达水平保持稳定。
通过将目标基因的拷贝数除以参考基因的拷贝数，我们可以得到一个表示目标基因表达水平变化程度的相对值。
3. δCt推导步骤δCt是一种用于计算两个样本之间差异的方法，它通过计算两个样本的Ct值差异来确定目标基因在不同条件下的表达变化。
以下是δCt推导的步骤：步骤1：收集实验数据首先，我们需要进行实时荧光定量PCR实验，并记录每个样本中目标基因和参考基因的Ct值。
Ct值是一个反映PCR扩增周期数的指标，通常越低表示目标基因拷贝数越多。
步骤2：计算ΔCt值ΔCt表示目标基因和参考基因之间的Ct值差异。
计算ΔCt可以使用以下公式：ΔCt = Ct(target) - Ct(reference)其中，Ct(target)代表目标基因在样本中的Ct值，Ct(reference)代表参考基因在样本中的Ct值。
步骤3：计算δCt值δCt是指相对于某个参考样本，目标样本与该参考样本之间的ΔCt差异。
计算δCt可以使用以下公式：δCt = ΔCt(sample) - ΔCt(reference)其中，ΔCt(sample)代表目标样本和参考样本之间的ΔCt值，ΔCt(reference)代表参考样本和参考样本之间的ΔCt值。
利用实时定量PCR和2_-△△CT_法分析基因相对表达量
2－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。经内标基因均一化处理後，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，△△CT=0，而20=1。所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2－△△CT。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。
整理得：
任一样品X0,q 除以参照品X0,cb 得：
在这里△ C'T=CT,q-CT,cb 。△C’T与前面计算中用的△CT（用目标基因CT值减去参照基因CT值）相互区别。
就象在1.1部分所描述的，如果条件优化较好，效率接近于1，内标相对于参照因子为：
2.2. 2－△Cf方法的应用
在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。因此对每一个样本分别处理，通过计算後取结果的平均值就非常重要。如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均CT，然後再进行 计算。怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。表 1 给出了目标基因（c- myc ）和内参基因（GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT 来计算△CT 。重复实验中CT值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。但其中的一个难点是 CT值与相应的拷贝数成指数关系（见第4 部分），因此，在最後的计算中，的误差通过△△CT 加上标准偏差和△△CT 减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比较造成的。
qpcr相对定量计算方法
qpcr相对定量计算方法
qPCR相对定量计算方法通常使用2-ΔΔCt法，这是最常用的方法。
它适用于比较不同样本中的基因表达量。
下面是使用2-ΔΔCt法计算相对表达量的步骤：
1.测量样本的Ct值。
在qPCR检测过程中，每个反应的CT值表示基因在样本中的表达量。
CT值是一个数值，表示转录量在翻倍的周期数。
2.计算∆Ct。
将目标基因的Ct值减去一个参考基因的Ct值，计算出基因表达量与参考基因表达量之间的差异，即∆Ct。
3.计算∆∆Ct。
将每个实验样品的∆Ct值与参考样品的∆Ct值进行比较。
使用参考样品的∆Ct值减去实验样品的∆Ct值，计算出基因表达量之间的相对差异，即∆∆Ct。
4.将∆∆Ct值代入2-ΔΔCt公式以计算相对表达量。
当参考基因表示稳定的基因表达不变时，2-ΔΔCt公式允许研究者计算标准化基因的相对表达量。
荧光定量pcr基因相对表达量计算方法
荧光定量pcr基因相对表达量计算方法Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) is a widely used technique in molecular biology to measure gene expression levels. It is often used to analyze the relative expression of genes in different samples. For researchers studying gene expression, calculating the relative gene expression levels is crucial for understanding the biological processes underlying various cellular activities.荧光定量PCR（qPCR）是分子生物学中广泛使用的一种技术，用于测量基因表达水平。
它通常用于分析不同样本中基因的相对表达量。
对于研究基因表达的研究人员来说，计算基因的相对表达水平对于理解各种细胞活动背后的生物过程至关重要。
One common method for calculating gene expression is the 2^-ΔΔCT method. This method involves first determining the threshold cycle (CT) values for both the gene of interest and the reference gene in each sample. The ΔCT value is then calculated by subtract ing the reference gene CT value from the gene of interest CT value. The ΔΔCT value is obtained by subtracting the ΔCT value of the control sample from the ΔCT value of the experimental sample.一种常见的计算基因表达的方法是2^-ΔΔCT方法。
检测基因表达的方法
检测基因表达的方法基因表达检测是一个生物学检测方法。
背景知识荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。
随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。
实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。
服务项目1．相对定量包括RNA提取、反转录和扩增，采用SYBR Green I法和TaqMan探针法两种方式，一般采用2- ΔΔ Ct 法进行计算。
每个样本重复三次，一般情况我公司提供内参基因引物。
2．绝对定量需要制备标准品并建立标准曲线，然后检测目的样本中的基因，比对标准曲线得到基因准确拷贝数。
送样要求细胞（≥106 ）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、叶片（≥100mg）等样品材料，基因组DNA或总RNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
提供结果引物和探针及序列，反转录胶图，原始数据（包括扩增曲线和熔解曲线）、数据分析结果及实验报告。
检测基因表达的方法有哪些主要用探针检测mRNA或用抗体检测出表达的蛋白质(转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测)一、外源基因转录水平的鉴定基因表达分为转录及翻译两阶段，转录是以DNA（基因）为模板生成mRNA的过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白质的过程，检测外源基因的表达就是检测特异mRNA及特异蛋白质的生成。
所以基因表达检测分为两个水平。
即转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测。
转录水平上的检测主要方法是Northern杂交，它是以DNA或RNA 为探针，检测RNA链。
和Southern杂交相同，Northern杂交包括斑点杂交和印迹杂交。
利用实时定量PCR和2 -△△CT 法分析基因相对表达量
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
实时荧光基因相对表达数据处理△△CT
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理相对定量△CT 和2-△△CT方法一、实时荧光原理及其中的概念实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。
废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。
实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
qPCR中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，因此在PCR每个循环的延伸(双链图2)过程中检测荧光信号，可以绘制原始的扩增曲线。
如下图1：图1：PCR扩增曲线图2 ：双链发射荧光nR n荧光信号量，n为循环数扩增曲线可以分为：图31.基线期：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基线。
2. 对数期 ：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线3. 平台期 ：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP 的消耗殆尽,不会再有新的DNA 链产生了,就进入到平台期了实时荧光PCR 中重要的概念：CT 、扩增效率CT 值（Cycle threshold value ）：实时荧光PCR 过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。
起始模板DNA 量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct 值越小。
Log 模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
扩增效率E （efficiency ）：理想的PCR 反应在指数期应该是Rn=R 0 * 2n（Rn ，n 次循环产物量。
R 0，初始模板量。
采用2-δct 法计算目的mirna的相对表达量
采用2-δct 法计算目的mirna的相对表达量2-ΔΔCt法是相对定量的PCR方法，用于研究基因的表达差异。
在使用该方法时需要先采用
实验室仪器检测RNA或DNA的含量，然后设计引物，反转录成cDNA，再进行PCR，最后利用消
耗性染料SYBR Green检测产生的PCR产物量。
下面是2-ΔCt法计算目的miRNA的相对表达量的详细步骤：
1. RNA提取和定量：从样品中提取总RNA，并利用紫外线分光光度计或其他适当的方法测定RNA的浓度和纯度。
2. 反转录成cDNA：根据所选的反转录试剂盒说明书的步骤，将RNA转化为cDNA。
3. Real-time PCR分析并检测：使用Real-time PCR检测得到的cDNA，进行PCR程序，一般可
以选择 ABI7500等仪器来完成此步骤。
4. 比较CT值：对于样本中每种miRNA，计算其CT值，即代表其荧光信号强度的阈值循环数。
5. 计算△CT：对于每个样本中的miRNA，减去一个内部参比基因（如U6 snRNA），计算其CT 值的差异（ΔCt）。
6. 计算△△CT：将目标miRNA样本的ΔCt值和对照组ΔCt值作差，得到△△Ct（即ΔΔCt）。
7. 计算相对表达量：根据公式“2-ΔΔCt”计算目标miRNA的相对表达量。
其中，ΔΔCt值
代表目标样本与对照样本之间的Ct差异。
总之，2-ΔΔCt法是一种常用的PCR方法，可以比较准确地计算不同样品或组间的基因或miRNA表达差异。
但需要注意的是，这个方法仍然存在一些限制和局限性，如PCR效率等影响因
素需要非常谨慎地控制和分析。
基因组数据分析与表达量
基因组数据分析与表达量基因组数据分析与表达量是生物学和基因组学领域的核心课题之一。
随着高通量测序技术的发展，大量的基因组数据被产生并储存，为研究基因的功能和表达模式提供了丰富的资源。
本文将从基因组数据的分析方法和基因表达量的计算两个方面进行论述。
一、基因组数据的分析方法1. DNA测序数据分析DNA测序数据是最常见的基因组数据类型之一。
DNA测序技术的发展，如Sanger测序、Illumina测序等，使得高质量、高通量的DNA测序数据得以产生。
对于DNA测序数据的分析主要包括序列比对、SNP检测、突变分析等。
序列比对是指将测序reads与参考基因组进行比对，以确定其来源位置和突变情况。
SNP检测是指鉴定单核苷酸多态性位点，用于研究个体之间的差异和遗传变异。
突变分析则着重于寻找与疾病相关的突变位点，例如癌症基因组的突变。
2. RNA测序数据分析RNA测序数据是研究基因表达的重要数据源。
RNA测序技术可通过转录组测序，揭示不同组织、不同发育阶段、疾病状态下各种RNA分子的表达情况。
RNA测序数据的分析主要包括基因表达量计算、差异表达基因鉴定、功能注释等。
基因表达量计算是将测序reads定量到各个基因上，从而确定基因在特定条件下的表达水平。
差异表达基因分析则用于找出在不同条件下表达有显著变化的基因，以揭示特定生理或病理过程的调控机制。
功能注释则是对差异表达基因进行生物学功能分析和通路富集分析，以从功能角度解读基因表达差异的意义。
二、基因表达量的计算基因表达量的计算是RNA测序数据分析的核心任务之一。
以下介绍常用的基因表达量计算方法。
1. TPM（Transcripts Per Million）TPM是一种相对表达量的计算方法。
它通过将每个基因的表达水平除以所有基因表达水平的总和，并乘以一百万，得到每个基因的TPM 值。
TPM计算方法可以很好地纠正测序深度的差异，从而实现样本间的比较。
2. FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）FPKM是另一种常用的相对表达量计算方法。
内标基因的相对表达量
现在的文献一般写有两种相对定量的方法，一种为2－△△Ct法，另一种是相对标准曲线法。
2－△△Ct推导过程假设有未处理样品标为0、处理样品标为1；目的基因标为m、内标基因标为n这样，未处理样品中目的基因的拷贝数为Xm0、内标基因的拷贝数为Xn0;处理样品中目的基因的拷贝数为Xm1、内标基因的拷贝数为Xn1;目的基因的扩增效率Exm、内标基因的扩增效率Exn一定阈值下得到的未处理样品中目的基因的Ct值为Ctm0、内标基因的Ct值为Ctn0;一定阈值下得到的处理样品中目的基因的Ct值为Ctm1、内标基因的Ct值为Ctn1;根据PCR反应动力学公式：E = X0*(1+Ex)n + Eb(Eb为荧光背景值，E为n次循环对应的荧光强度)，在给定阈值的前提下，我们不难得出下面两式：（1）Xm1*(1+Exm)Ctm1 = Xm0*(1+Exm)Ctmo（2）Xn1*(1+Exn)Ctn1 = Xn0*(1+Exn)Ctno（这两个公式忽略了荧光背景值：我们检测的并不是拷贝数，而是与拷贝数相对应的荧光信号。
因为未处理样品与处理样品的荧光背景肯定会不同）两式相除得：（3）(Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0) = (1+Exm) Ctm0-Ctm1/（1+Exn）Ctn1-Ctn0如果目的基因扩增效率与内标基因扩增效率相同，即Exm＝Exn＝E＝100％则：(Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0)＝2－△△Ct从以上推导过程可以看出：此法忽略了荧光背景、目的基因与内标基因扩增效率不同并不可能为100％这两种情况所造成的影响。
相对标准曲线法根据人为确定的目的基因和内标基因的拷贝数进行倍比稀释，来得出它们各自的标准曲线。
之后按照样品的Ct值在标准曲线上作一对应算出拷贝数，两者相除分别得到得到两个不同样品中目的基因的相对表达量、内标基因的相对表达量。
然后再将两者相除，得到目的基因相对于内标基因的表达差异值。
此方法的原理也可从上面的公式推导出来：（1）式两边相除为Xm1/Xm0 =（1+Exm）Ctm0-Ctm1（由目的基因的相对标准曲线可算出Xm1/Xm0具体值）（2）式两边相除为Xn1/Xn0 = (1+Exn) Ctn0-Ctn1（由内标基因的相对标准曲线可算出Xn1/Xn0具体值）两式相除即可得出(Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0)值，由此可以看出相对标准曲线法并没有忽略目的基因与内标基因扩增效率之间的差异，只是忽略了荧光背景值不同而造成的影响。
基因相对表达量
基因相对表达量
基因表达是指基因在特定细胞环境中的活性水平，它是基因功能的重要指标。
基因相对表达量是指在不同细胞环境中，同一基因的表达量的比较。
它可以帮助我们了解基因在不同细胞环境中的表达情况，从而更好地理解基因的功能。
基因相对表达量的测定可以通过多种方法实现，其中最常用的是定量PCR（qPCR）。
它可以检测基因在不同细胞环境中的表达量，并且可以比较不同细胞环境中同一基因的表达量。
它的优点是灵敏度高，可以检测出微量的基因表达，而且可以快速准确地测定基因的相对表达量。
基因相对表达量的测定可以帮助我们更好地理解基因的功能。
例如，我们可以比较不同细胞环境中同一基因的表达量，从而了解基因在不同细胞环境中的表达情况，从而更好地理解基因的功能。
此外，基因相对表达量的测定还可以帮助我们发现基因的调控机制，从而更好地控制基因的表达。
总之，基因相对表达量的测定是一种重要的技术，可以帮助我们更好地理解基因的功能，发现基因的调控机制，从而更好地控制基因的表达。
目的基因相对表达量计算公式
目的基因相对表达量计算公式
目的基因相对表达量计算公式是通过比较目的基因与参考基因之间的相对表达水平计算得出的。
其计算公式为：
目的基因相对表达量= 2^-ΔCt
其中，ΔCt表示目的基因的Ct值减去参考基因的Ct值，2表示PCR扩增反应的倍增数。
通过该公式，可以得出目的基因的相对表达量，用于比较不同样本之间目的基因的表达水平。
需要注意的是，该公式仅适用于实时荧光定量PCR（qPCR）技术，且需要进行数据标准化和校正，以保证实验结果的准确性和可靠性。
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利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。
2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT 公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User BulletinNo.2（P/N4303859）中有介绍。
用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。
本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。
另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。
1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X是初始目标分子数，Ex是目标分子扩增效率，n 是循环数，CT代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
因此：XT是目标分子达到设定的阈值时的分子数。
C T,X是目标分子扩增达到阈值时的循环数。
Kx是一个常数。
对于内参反应而言，也有同样的公式：用XT 除以RT得到：对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。
因此常数K 并不一定等于1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或：X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△C T 表示目标基因和内标基因C T 值的差异（C T,X －C T,R ）整理上式得：最后用任一样本q 的X N 除以参照因子（calibrator, cb ）的X N 得到：在这里对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。
因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是1.2. 2－△△CT 方法的假设和应用要使△△CT 计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。
看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物△CT 如何变化。
图1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。
对于每一个稀释样本，都用GAPDH 和c-myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。
计算出c-myc 和GAPDH 的平均CT 值以及△CT值，通过cDNA 浓度梯度的log值对△CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△CT方法进行相对定量。
在图1中，直线斜率是0.047，因而假设成立，△△CT方法可以用来分析数据。
如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。
1.3. 2－△△CT内标和参照因子的选择使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA 进行均一化处理。
标准的看家基因一般都可被用作内标基因。
适合于实时 PCR 反应内标基因包括GAPDH，β -actin，β2-microglobulin 以及rRNA 。
当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。
我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。
验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2 部分有描述。
2－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。
最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。
经内标基因均一化处理後，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。
对于未经处理的参照样，△△CT=0，而20=1。
所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。
而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2－△△CT。
同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。
有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。
例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。
在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。
表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-myc 和GAPDH 转录本的CT 值。
在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏c-myc 表达量经GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。
尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。
不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。
1.4. 2－△△CT方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。
为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。
通过β-actin 均一化处理，我们对目标基因fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。
在8h 的时间范围内，在每一时间点都取3 个重复样本，每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，数据分析用到了公式9，即：Time x 表示任意时间点，Time 0表示经β -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。
（见图2 第8 栏）被用于公式9 中。
通过0 时刻目标基因和内标基因的平均CT公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过β -actin 均一化处理後相对于0时刻的倍数（见图2 第9 栏）。
平均SD，CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。
用这种分析方法，在0 时刻的平均倍数变化接近于1。
我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。
如果得到的结果与1偏差很大，则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。
在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。
因此对每一个样本分别处理，通过计算後取结果的平均值就非常重要。
如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均CT，然後再进行计算。
怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。
表 1 给出了目标基因（c- myc ）和内参基因（GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。
在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT 来计算△CT。
重复实验中CT值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。
但其中的一个难点是 CT值与相应的拷贝数成指数关系（见第4 部分），因此，在最後的计算中，的误差通过△△CT 加上标准偏差和△△CT减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。
不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比较造成的。
通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。
表2 给出了目标基因（c- myc）和内标基因（GAPDH）在同一管中扩增的实验数据。
对于任意一个管子，目标基因（c- myc）和内参基因（GAPDH）扩增时加入的cDNA 量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△CT值，这些值取平均后再进行计算。
在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。
在表1 和表2 中，估计误差在从△CT 到△△CT的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。
我们把△CT，cb 当作一个人为设定的常数来减去，得到△△CT 。
这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的CT 值求实所得结果相当。
另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的1倍的量，在这种情况下，平均△CT,cb的误差值被引入到每一样本的△△CT 中。
在表1中，肾脏中△△CT变成- 2.50±0.20而经过校正的c-myc 量是5.6 倍，范围从4.9 到 5.6 。
而在大脑中的结果是没有误差的1倍。
2. 2－△Cf方法2.1. 2－△Cf方法的推导通过内标RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。
2－△△CT方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。