生物标志物实验pptPowerPointPresen(1)
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(推荐)《生物指示物》PPT课件
背景介绍
1
背景介绍
生物易被环境中过量的污染物或自然物质影响， 这些影响可能表现在如下几个方面：
1）生物群落中种群结构或者优势种群的改变； 2）群落中种群多样化的改变； 3）生物群体中死亡率增加，特别是早期发育的
敏感期如卵和幼虫阶段； 4）个体生理和行为的改变； 5）个体形态学和组织学出现问题； 6）个体的组织中积累污染物或者代谢物。
间接ELISA操作步骤及原理
固相 酶标底物 （二抗）
抗原
包被抗原 洗涤
加被检标本
一抗
加入酶结合物
洗涤
加显色剂和终止剂
28
PCR技术
PCR技术即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是在体外合成特异性DNA片段的 方法，可以快速扩增目的基因DNA或RNA片段， 是对基因克隆，分子杂交和序列分析等分子生 物学方法的丰富和发展。
26
生物标志物的一些测定方法
• 免疫学方法 酶免疫监测（enzyme immunoassay, EIA）是 根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以 酶作为标记物，与已知抗体结合，但不影 响其免疫学特性，然后将酶标记物的抗体 作为标准试剂来鉴定未知的抗原。
酶联免疫吸附测试（enzyme linked immunosorbent assay, ELIAS）是目前最常 用的监测方法。它是根据EIA的原理而发展 的一种固相免疫技术，其试剂盒基于竞争 27
14
幼虫变态实验
近年来对于以海洋无脊椎动物的胚胎和幼虫期 毒性实验研究较为广泛，有关研究表明，浮游 幼虫变态比现有生物个体水平的毒性实验指标 更为敏感。
海洋底栖无脊椎动物幼虫的变态期是生活史的 关键阶段，变态期幼体对污染物的敏感性要高 于其他阶段，胚胎发生和幼虫发育不受影响的 污染物浓度会阻碍其变态。
1
背景介绍
生物易被环境中过量的污染物或自然物质影响， 这些影响可能表现在如下几个方面：
1）生物群落中种群结构或者优势种群的改变； 2）群落中种群多样化的改变； 3）生物群体中死亡率增加，特别是早期发育的
敏感期如卵和幼虫阶段； 4）个体生理和行为的改变； 5）个体形态学和组织学出现问题； 6）个体的组织中积累污染物或者代谢物。
间接ELISA操作步骤及原理
固相 酶标底物 （二抗）
抗原
包被抗原 洗涤
加被检标本
一抗
加入酶结合物
洗涤
加显色剂和终止剂
28
PCR技术
PCR技术即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是在体外合成特异性DNA片段的 方法，可以快速扩增目的基因DNA或RNA片段， 是对基因克隆，分子杂交和序列分析等分子生 物学方法的丰富和发展。
26
生物标志物的一些测定方法
• 免疫学方法 酶免疫监测（enzyme immunoassay, EIA）是 根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以 酶作为标记物，与已知抗体结合，但不影 响其免疫学特性，然后将酶标记物的抗体 作为标准试剂来鉴定未知的抗原。
酶联免疫吸附测试（enzyme linked immunosorbent assay, ELIAS）是目前最常 用的监测方法。它是根据EIA的原理而发展 的一种固相免疫技术，其试剂盒基于竞争 27
14
幼虫变态实验
近年来对于以海洋无脊椎动物的胚胎和幼虫期 毒性实验研究较为广泛，有关研究表明，浮游 幼虫变态比现有生物个体水平的毒性实验指标 更为敏感。
海洋底栖无脊椎动物幼虫的变态期是生活史的 关键阶段，变态期幼体对污染物的敏感性要高 于其他阶段，胚胎发生和幼虫发育不受影响的 污染物浓度会阻碍其变态。
重症常用生物标记物ppt课件
0.1-0.25ng/mL
>0.25-0.5ng/mL
>0.5ng/mL
强烈建议不用抗生素
建议不使用抗生素
建议可以使用抗生素
强烈建议使用抗生素
在6-24小时后追踪PCT 可以在下述情况下首次使用抗生素：
呼吸道或血液动力学的不稳定 威胁生命的合并症 需要入住ICU PCT<0.1ng/mL:
CAP且PSI为V或CURB-65>3， COPD 且GOLD为IV PCT<0.25ng/mL: CAP且PSI为V或CURB-65>2， COPD 且GOLD≥III 局部感染（脓肿、积脓症） 宿主抵抗力减弱 （例如：免疫抑制而非皮质甾类） 并发感染需要使用抗生素
重症常用生物标记物
郴州市第一人民医院重症医学科 王盛标
2019
-
1
生物标记物简介
➢ 生物标志物是一种能将其分为小分子生物标志物、大分子生物标志 物、复合生物标志物和生物种群标志物。
➢ 生物标志物可用于疾病的诊断和分类，监测疾病的发展和 严重程度，检验临床治疗效果，预测个体发病的风险，并 可用于高危人群筛查
2019
-
4
降钙素原 PCT产生
➢ 通过病原微生物分泌的毒素（细菌内毒素）直接诱导细胞 内信号传导产生
➢ 间接通过促炎因子（白介素1、6、8及肿瘤坏死因子）诱 导产生
➢ 介导宿主细胞进行免疫应答产生
2019
-
5
PCT的值与感染程度关系
201新 长9期生血儿液出透生析后2患d者内血PC浆TP生C理T值性可增达高1，.5最ng高/m达l 21ng-/ml
在急性相 6～12 h 浓度增高
24～48 h 后达高峰
生物指示物课件ppt
土壤污染监测
生物指示物可以监测土壤中的有害物质，如重金属、有机污染物 等，有助于评估土壤质量和采取修复措施。
药物研发与生产
药物筛选
生物指示物可以用于药物 筛选过程中，帮助筛选出 具有潜在疗效的药物候选 物。
药物代谢研究
生物指示物可以用于研究 药物的代谢过程和机制， 有助于药物设计和优化。
药物生产质量控制
加强国际合作与交流
加强国际间的合作与交流，共同制定生物指示物的国际标准，推动 标准化和规范化进程。
提高生物指示物的灵敏度和特异性
01
优化生物指示物设计
通过改进生物指示物的设计和制备方法，提高其灵敏度和特异性。
02
采用多指标检测
采用多个生物指示物联合检测的方法，可以更准确地反映目标物的存在
和浓度。
03
生物指示物课件
目 录
• 生物指示物概述 • 常见生物指示物介绍 • 生物指示物的检测方法 • 生物指示物的应用案例 • 生物指示物的未来发展
01
生物指示物概述
定义与分类
定义
生物指示物是指那些能够指示环境变化或污染状况的生物种 类或种群，它们对环境中的物理、化学或生物因子变化敏感 ，可以作为环境监测和评估的指标。
分类
根据其指示的性质，生物指示物可以分为两类，即直接指示 物和间接指示物。直接指示物是指那些直接暴露于污染物或 环境变化中的生物，而间接指示物则是通过其生理、行为或 繁殖等反应来指示环境变化的生物。
生物指示物的应用领域
生态风险评估
生态恢复
生物指示物可用于评估污染物对生态 系统的影响和风险，通过监测生物种 群的变化，可以了解污染物的生态毒 性。
免疫荧光技术
利用荧光标记的抗体与微生物的特异性结合，通过荧光信号的强度和分布来判断微生物的数量和种类 。
生物指示物可以监测土壤中的有害物质，如重金属、有机污染物 等，有助于评估土壤质量和采取修复措施。
药物研发与生产
药物筛选
生物指示物可以用于药物 筛选过程中，帮助筛选出 具有潜在疗效的药物候选 物。
药物代谢研究
生物指示物可以用于研究 药物的代谢过程和机制， 有助于药物设计和优化。
药物生产质量控制
加强国际合作与交流
加强国际间的合作与交流，共同制定生物指示物的国际标准，推动 标准化和规范化进程。
提高生物指示物的灵敏度和特异性
01
优化生物指示物设计
通过改进生物指示物的设计和制备方法，提高其灵敏度和特异性。
02
采用多指标检测
采用多个生物指示物联合检测的方法，可以更准确地反映目标物的存在
和浓度。
03
生物指示物课件
目 录
• 生物指示物概述 • 常见生物指示物介绍 • 生物指示物的检测方法 • 生物指示物的应用案例 • 生物指示物的未来发展
01
生物指示物概述
定义与分类
定义
生物指示物是指那些能够指示环境变化或污染状况的生物种 类或种群，它们对环境中的物理、化学或生物因子变化敏感 ，可以作为环境监测和评估的指标。
分类
根据其指示的性质，生物指示物可以分为两类，即直接指示 物和间接指示物。直接指示物是指那些直接暴露于污染物或 环境变化中的生物，而间接指示物则是通过其生理、行为或 繁殖等反应来指示环境变化的生物。
生物指示物的应用领域
生态风险评估
生态恢复
生物指示物可用于评估污染物对生态 系统的影响和风险，通过监测生物种 群的变化，可以了解污染物的生态毒 性。
免疫荧光技术
利用荧光标记的抗体与微生物的特异性结合，通过荧光信号的强度和分布来判断微生物的数量和种类 。
生物实验ppt课件
细胞培养的步骤
细胞培养的过程包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等步骤。这些步骤 都需要严格的无菌操作，以保证细胞的存活和实验结果的可靠性。
03
细胞培养的应用
细胞培养技术在生物医学研究中具有广泛的应用，如药物筛选、毒理学
研究、基因治疗等。通过细胞培养技术，可以深入了解细胞的生理和病
理过程，为疾病诊断和治疗提供有力支持。
生物信息学的价值
生物信息学技术在生命科学领域中具 有广泛的应用价值。例如，在医学领 域中，生物信息学技术可用于疾病预 测、个性化治疗和药物研发等方面； 在农业领域中，生物信息学技术可用 于作物抗逆性分析和新品种选育等。 同时，生物信息学技术的发展也促进 了跨学科的合作与交流，推动了生命 科学研究的进步和发展。
生物实验的类型与分类
类型
根据实验目的和手段的不同，生物实 验可以分为观察性实验、验证性实验 、探究性实验和模拟实验等。
分类
按照研究领域和对象的不同，生物实 验可以分为动物学实验、植物学实验 、微生物学实验、遗传学实验等。
生物实验的基本原则与注意事项
基本原则
科学性原则、对照性原则、随机性原则、可重复性原则等。
准备细胞和培养瓶
确保细胞处于适宜的生长状态，准备 好清洁、消毒的培养瓶。
消化细胞
加入胰蛋白酶等消化酶，使细胞从瓶 壁上分离下来。
分散细胞
轻轻吹打、搅拌使细胞充分分散。
接种细胞
将分散的细胞接种到新的培养瓶中。
培养细胞
将培养瓶放入恒温培养箱中，保持适 宜的温度和湿度，进行细胞培养。
THANKS
感谢观看
生物信息学技术
生物信息学技术
生物信息学技术是以计算机科学和统 计学为基础，通过对生物数据进行分 析和挖掘，揭示生命现象内在规律的 科学方法。常见的生物信息学技术包 括基因组学、转录组学和蛋白质组学 等。
细胞培养的过程包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等步骤。这些步骤 都需要严格的无菌操作，以保证细胞的存活和实验结果的可靠性。
03
细胞培养的应用
细胞培养技术在生物医学研究中具有广泛的应用，如药物筛选、毒理学
研究、基因治疗等。通过细胞培养技术，可以深入了解细胞的生理和病
理过程，为疾病诊断和治疗提供有力支持。
生物信息学的价值
生物信息学技术在生命科学领域中具 有广泛的应用价值。例如，在医学领 域中，生物信息学技术可用于疾病预 测、个性化治疗和药物研发等方面； 在农业领域中，生物信息学技术可用 于作物抗逆性分析和新品种选育等。 同时，生物信息学技术的发展也促进 了跨学科的合作与交流，推动了生命 科学研究的进步和发展。
生物实验的类型与分类
类型
根据实验目的和手段的不同，生物实 验可以分为观察性实验、验证性实验 、探究性实验和模拟实验等。
分类
按照研究领域和对象的不同，生物实 验可以分为动物学实验、植物学实验 、微生物学实验、遗传学实验等。
生物实验的基本原则与注意事项
基本原则
科学性原则、对照性原则、随机性原则、可重复性原则等。
准备细胞和培养瓶
确保细胞处于适宜的生长状态，准备 好清洁、消毒的培养瓶。
消化细胞
加入胰蛋白酶等消化酶，使细胞从瓶 壁上分离下来。
分散细胞
轻轻吹打、搅拌使细胞充分分散。
接种细胞
将分散的细胞接种到新的培养瓶中。
培养细胞
将培养瓶放入恒温培养箱中，保持适 宜的温度和湿度，进行细胞培养。
THANKS
感谢观看
生物信息学技术
生物信息学技术
生物信息学技术是以计算机科学和统 计学为基础，通过对生物数据进行分 析和挖掘，揭示生命现象内在规律的 科学方法。常见的生物信息学技术包 括基因组学、转录组学和蛋白质组学 等。
生物指示物PPT
• DNA-加合物测定:免疫法、荧光法、32P-后标记法
• 蛋白加合物:血红蛋白（Hb）-加合物（色谱-质谱法、免疫法）
• 生物群落监测法
• 付生植物群落监测法:地衣生长绘图法 • 微生物监测法:大气污染微生物监测法、水污染的细菌学监测、
微型生物群落监测法（如PFU法） • 底栖大型无脊椎动物监测法 • 微宇宙法:标准化水生微宇宙（SAM）、土壤核心微宇宙（SCM）
• 监测指标的选择应遵循的原则
根据监测目的 根据污染物的性质和毒理作用机制 根据生物的特性
10
1 生物监测
• 生物监测的方法
生态学方法生理学方法 毒理学和遗传毒理学方法 生物化学成分分析方法
11
1 生物监测
• 生物预警和监测环境变化的机理
• 人为胁迫下生物系统会对受损环境发生一些在自然条件下 没有或罕见的生物反应，这种反应可以发生在生物系统的 基因、细胞、组织、器官、个体、种群、群落及生态系统 的各个层次。反应强度与环境受损程度存在着相关性，是 利用生物对环境变化进行监测、预警的基础。
7
1 生物监测
• 生物监测：利用生物分子、细胞、组织、 器官、个体、种群和群落以及生态系统等 层次上的变化对人为胁迫的生物学响应反 应来阐明环境状况。即用生物作指标对环 境质量变化进行指示，从生物学的角度对 环境质量变化进行监测，为环境质量评价 提供依据。
8
1 生物监测
·利用生物对环境进行监测和预警历史悠久
上述效应的研究促使生物调查/监视（Biological Surveillance） 方法用于替代（或至少是补充）化学分析方法监测环境质量。在一段 时间内同一环境中生物调查包括一系列相似的调查内容，因此是动态 的。若生物调查具有特殊目的，如按规范规定的污染物，则称为生物 监测（Biological monitoring/ Biomonitoring）。
• 蛋白加合物:血红蛋白（Hb）-加合物（色谱-质谱法、免疫法）
• 生物群落监测法
• 付生植物群落监测法:地衣生长绘图法 • 微生物监测法:大气污染微生物监测法、水污染的细菌学监测、
微型生物群落监测法（如PFU法） • 底栖大型无脊椎动物监测法 • 微宇宙法:标准化水生微宇宙（SAM）、土壤核心微宇宙（SCM）
• 监测指标的选择应遵循的原则
根据监测目的 根据污染物的性质和毒理作用机制 根据生物的特性
10
1 生物监测
• 生物监测的方法
生态学方法生理学方法 毒理学和遗传毒理学方法 生物化学成分分析方法
11
1 生物监测
• 生物预警和监测环境变化的机理
• 人为胁迫下生物系统会对受损环境发生一些在自然条件下 没有或罕见的生物反应，这种反应可以发生在生物系统的 基因、细胞、组织、器官、个体、种群、群落及生态系统 的各个层次。反应强度与环境受损程度存在着相关性，是 利用生物对环境变化进行监测、预警的基础。
7
1 生物监测
• 生物监测：利用生物分子、细胞、组织、 器官、个体、种群和群落以及生态系统等 层次上的变化对人为胁迫的生物学响应反 应来阐明环境状况。即用生物作指标对环 境质量变化进行指示，从生物学的角度对 环境质量变化进行监测，为环境质量评价 提供依据。
8
1 生物监测
·利用生物对环境进行监测和预警历史悠久
上述效应的研究促使生物调查/监视（Biological Surveillance） 方法用于替代（或至少是补充）化学分析方法监测环境质量。在一段 时间内同一环境中生物调查包括一系列相似的调查内容，因此是动态 的。若生物调查具有特殊目的，如按规范规定的污染物，则称为生物 监测（Biological monitoring/ Biomonitoring）。
浅谈生物标志物监测的质量保证PPT(19张)
制
尿中δ-氨基乙酸丙酸的测定 WS/T23-
措
1996
施
尿
样
一、尿样的监测质控
和
1、根据毒物在体内的半减期确定尿样采样 时间 （机）
血
迅速排出的毒物 班末尿 尿酚
样
排泄较稳定的毒物 一次尿 尿铅
监
排泄无规律的毒物 晨尿
尿汞
测
2、肌酐校正、尿比重校正，避免尿液稀 释、浓缩影响测定结果
质
控
二、血样的监测质控
最常用的是
尿液 血液 呼出气
二、生物标志物及其分类
能反映生物体与环境因素（理化生社心等）相互作 用所致的一切生理、病理生理学和病理学改变，称为：
生物标志物（biomaker）
接触生物标志物 （biomaker of exposure
易感生物标志物 （biomaker of susceptibility)
•
4、世界上只有想不通的人，没有走不通的路。将帅的坚强意志，就像城市主要街道汇集点上的方尖碑一样，在军事艺术中占有十分突出的地位。
•
5、世上最美好的事是：我已经长大，父母还未老;我有能力报答，父母仍然健康。
•
6、没什么可怕的，大家都一样，在试探中不断前行。
•
7、时间就像一张网，你撒在哪里，你的收获就在哪里。纽扣第一颗就扣错了，可你扣到最后一颗才发现。有些事一开始就是错的，可只有到最后才不得不承认。
职业环境监测 职业性有害因素的接触评定及危险度评定 建设项目职业病危害预评价 职业病危害控制效果评价 作业场所空气中化学物质接触限值的制定 职业病鉴定（病因学研究）
确保检测结果的准确性、可比性和公证性 才能准确识别和评价有害因素的危害性质和程 度，有效地控制职业性有害因素的危害。
生物标志化合物PPT学习教案
（4）二萜
二萜类广泛分布于高等植物，特别是树脂中，但在 原油和烃源岩中二萜类的报道较少，仅有的少数报 道主要涉及澳大利亚原油。有关二萜类的成因，许 多学者都比较一致地认为来源于树脂类化合物 。
松香烷
海松烷
贝壳松烷
惹烯
几种重要的二萜化合物
第28页/共108页
（5）倍半萜
成因比较复杂，许多学者提出了不同的观点。它 们可能来自有关的环状萜类生物或热降解；C15的 4β（H）-桉叶油烷与植物中的桉叶油醇有关，8β （H）-锥满烷来源于细菌中的锥满醇。也可由三环 藿烷烃碳环开环破裂而衍生。
第3页/共108页
生物 标志 物立 体化 学 生物天然产物的结构非常特殊，当地质圈里某 个生物标志物的所有立体结构能被确定时，就能确 定它与某个假定的天然前身物之间的联系。正是由 于它们高度的结构专一性，才成为地化有用的工具 。饱和碳原子具有四个键，如果A、B、C、D完全 不同的话，这个碳原子就有两种构型。
藿烷系莫烷列系列
（地质构型）
H H
R'
莫烷系列
H
R
8，14-断藿烷
R=R，C2H5 ，C3H7
17α H- 三降藿烷
Tm
（地质构型）
第25页/共108页
17，21-断藿烷
R=CH3 -C3H7
α
（2）四环萜烷
四环萜烷也较广泛分布于原油和岩石抽 提物中。目前认为这个系列的化合物由五 环三萜烷类烃热降解或生物降解而成（ Aquino Neto等，1983） 。目前发现的该 系列化合物分布于C24～C27，有可能分布到 C35（Peters等，1993），常以C24丰度最高 。
C17
20
15
10 5
生物标志物实验pptPowerPointPresen(1)
蛋白浓度
式中：OD620为待测样品620nm下的吸光度；K为 牛血清蛋白标准样曲线的斜率。
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
5 结果与报 告 1.急性毒性试验结果记录
曝气水 溶剂组 林丹 林丹 林丹 林丹 林丹 空白 对照 1ug/L 3ug/L 6ug/L 12ug/L 24ug/L
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
4 步骤与方 法
2．酶活力的测定 将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL
的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩 虾20～30min，加入9uL冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5）。 4℃下14000g离心3min，取100uL的上清。将此上清移 另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入 900uL空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用。
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
4 步骤与方 法
从上述的反应体系中取出200uL和Bio-Rad反应过 的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组 设三个平行，加入96孔板内。25℃下，摇动96孔板20s 后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋 白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。
法
3．总蛋白的测定
以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒 检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶 于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标准 液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该蛋 白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空 白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为0mL、 5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白标 准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净 的EP管中，加入200uL Bio-Rad产品。稀释缓冲液取 80uL的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入80uL的 0.1％的Triton X-100，用640uL磷酸缓冲液（pH=6.5）稀 释混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad产品。
式中：OD620为待测样品620nm下的吸光度；K为 牛血清蛋白标准样曲线的斜率。
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
5 结果与报 告 1.急性毒性试验结果记录
曝气水 溶剂组 林丹 林丹 林丹 林丹 林丹 空白 对照 1ug/L 3ug/L 6ug/L 12ug/L 24ug/L
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
4 步骤与方 法
2．酶活力的测定 将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL
的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩 虾20～30min，加入9uL冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5）。 4℃下14000g离心3min，取100uL的上清。将此上清移 另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入 900uL空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用。
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
4 步骤与方 法
从上述的反应体系中取出200uL和Bio-Rad反应过 的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组 设三个平行，加入96孔板内。25℃下，摇动96孔板20s 后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋 白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。
法
3．总蛋白的测定
以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒 检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶 于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标准 液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该蛋 白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空 白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为0mL、 5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白标 准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净 的EP管中，加入200uL Bio-Rad产品。稀释缓冲液取 80uL的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入80uL的 0.1％的Triton X-100，用640uL磷酸缓冲液（pH=6.5）稀 释混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad产品。
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1．器材
冷冻离心机（Beckman Coulter 22R centrifuge）， 酶标仪（Bio-Tek Instruments，INC）pH计，溶解氧测 定仪，电导率测定仪，96孔板，1.5mL离心管，水浴锅， 生物冰袋，移液枪（20uL、100uL、1000uL）及对应枪 头。
2．受试生物
成年雄性的钩虾（Gammarus pulex）。从野外采 集投放在 10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在 15℃ （±1℃），12h光照的条件下至少驯养一周，才能进行 染毒暴露。驯养期间，用接种了真菌（Cladospurium sp.）发酵1周的桤木叶（Alnus glutinosa L.）喂食。
溶剂组 对照
林丹 1 ug/L
林丹 3 ug/L
林丹 6 ug/L
林丹 12ug/L
林丹 24 ug/L
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/26
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
4 步骤与方 法
从上述的反应体系中取出200uL和Bio-Rad反应过 的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组 设三个平行，加入96孔板内。25℃下，摇动96孔板20s 后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋 白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。
取50mg林丹固体颗粒，溶于500mL的丙酮中配制成 100mg/L的林丹储存液，于4℃下阴暗处密封保存备用。
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
3 设备与材 料
（2）酶和缓冲液
①配置pH=6.5，0.02M磷酸缓冲液（PB） 利用此磷 酸缓冲液配制下面三种实验缓冲液：
（i）组织破碎缓冲液（HB）：含有1.0％Triton X100（v/v）和1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液；
蛋白浓度
式中：OD620为待测样品620nm下的吸光度；K为 牛血清蛋白标准样曲线的斜率。
生物标志物实验 pptPowerPointPresen(1)
5 结果与报 告 1.急性毒性试验结果记录
曝气水 溶剂组 林丹 林丹 林丹 林丹 林丹 空白 对照 1ug/L 3ug/L 6ug/L 12ug/L 24ug/L
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3 设备与材 料
3．试剂 1-氯-2，4-二硝基苯（CDNP），还原性谷胱甘肽
（GSH），谷胱甘肽转移酶标准品（GSTs），苯甲基磺 酰氟（PMSF），Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）， EDTA。 4．溶液的配制 （1）林丹储存液
⑤酶活测定液 实验之前配制，将CDNB和GSH溶液 从冰箱中取出，置于室温。取5份的20mmol/L GSH标准 液、9份的磷酸缓冲液（pH=6.5，0.02mol/L）和1份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活测定液。
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（ii）冲洗缓冲液（DB）：含有1.0％PMSF（v/v）的 磷酸缓冲液；
（iii）空白缓冲液（BB）：含有0.1％Triton X-100 （v/v）和1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液。
②100mmol/L PMSF溶液 用95％乙醇溶解适量的 PMSF，于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保存 5d。
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4 步骤与方 法
2．酶活力的测定 将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL
的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩 虾20～30min，加入9uL冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5）。 4℃下14000g离心3min，取100uL的上清。将此上清移 另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入 900uL空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用。
4 步骤与方 法
1．暴露试验 按照急性毒性试验方法，将雄性的成年钩虾分别暴
露于梯度林丹浓度中。暴露温度设定在15℃±1℃，光 暗比为12h︰12h。实验开始时测定各浓度梯度林丹曝 气水的溶解氧，pH和电导率。
暴露48h后，将存活的个体从容器中打捞出来，先 用吸水纸将表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚 乙烯离心管中（每管一只）。将这些离心管的放入液氮 罐20s以猝死钩虾。取出的离心管在-70℃保存。
（2）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。
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2 实验原理
谷胱甘肽转移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽转硫酶）是细 胞质内催化相Ⅱ反应起解毒作用的重要酶，具有许多同工 酶。污染物进入体内经过相Ⅰ反应后，在谷胱甘肽转移酶 的催化下，细胞内还原性谷胱甘肽能结合相Ⅰ反应产生的 亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有多 种的跨膜运输机制（如通过ATP推动GS-X泵）能使这类 亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并最终以尿 液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中， 谷胱甘肽结合作用是相Ⅱ反应的主要形式。
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3 设备与材 料
③40mmol/L CDNB溶液 用95％乙醇溶解适量的 CDNB，保存方法与PMSF相同。
④20mmol/L GSH标准液的配制 配制100mmol/L EDTA母液，用0.1mol/L KH2PO4稀释母液至EDTA的浓 度为1mmol/L。在1mmol/L的EDTA溶液中加人适量GSH 使其终浓度为20mmol/L。用1mol/L HCl或1mol/L KOH 校正pH。于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保 存5d。
溶解氧 （mg/L） 各实验 组参数 pH
电导率 （ms）
钩虾死 亡个体 数(只)
0（h） 24（h） 48（h）
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5 结果与报 告
2．酶活力与蛋白活力的测定试验结果记录
曝气水 空白
酶活测定OD340(min) 蛋白测定OD620
酶活(mol·L·g-1·min-1)
基于上述原因，用GSTs作为生物标志物来指示特定 的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得了广泛 的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水 生动物暴露于有机氯农药林丹（Lindane）之后，其体 内GSTs酶活性的变化。
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3 设备与材 料
GST酶活
式中：OD为吸光值随时间变化的斜率（OD340/min）； ε为摩尔吸光系数（9600mol-1cm-1）；R为反应系统体积 （uL）；S为样品上清的体积（uL）；W为样品蛋白浓度 （g/L）； P为样品厚度（0.6cm）。
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4 步骤与方
GSTs催化的一般反应为：
GSH +R-X = GSR + HX 在该反应中，GSTs的主要功能是通过其活性中心增 加GSH和亲电性底物的接触机会，然后激活GSH上琉基， 诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。
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2 实验原理
迄今的研究表明GSTs存在于所有的动物体内，肝脏 是脊椎动物种GSTs分布的主要场所。鼠肝中的GSTs占 可溶性肝蛋白的10％，而鱼肝中的GSTs也是可溶性肝 蛋白的主要成分。GSTs能被多种的污染物所诱导，如有 机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经 多环芳烃处理后，其肝脏中GSTs活性比对照组高1.5～ 2.0倍。在不同的水生动物体内GSTs可被多环芳烃诱导， 其活性高于对照组2倍。野外研究发现，在同一条河流中， 污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中GSTs含量和活 性比清洁断面高出3～4倍。然而，研究也发现GSTs活 性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质的影响， 存在较大的差异。
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2020/11/26
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目录
1
目的与要求
2
实验原理
3
设备与材料
4
步骤与方法
5
结果与报告
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1 目的与要 求
（1）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活 性影响。
法
3．总蛋白的测定
以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒 检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶 于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标准 液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该蛋 白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空 白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为0mL、 5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白标 准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净 的EP管中，加入200uL Bio-Rad产品。稀释缓冲液取 80uL的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入80uL的 0.1％的Triton X-100，用640uL磷酸缓冲液（pH=6.5）稀 释混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad产品。
在一个干净的1.5mL的离心管内加入500uL酶活为 1.4单位/mL的谷胱甘肽转移酶标准样品，加入500uL的 冷的空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀。
生物标志物实验 pptPowe6孔板中加入50uL的GST标准样品，钩虾组织液上清 或者空白缓冲液（BB），每组设四个平行。然后加入150uL 酶活测定液，使每个孔内含有200uL的反应液。将96孔板放入 酶表仪30℃轻微震荡反应30min，然后充分震荡96孔板以混合 各反应液。340nm下每隔1min记录一个吸光值，计算吸光值 随时间的变化的斜率。