基因工程的基本步骤

解读基因工程的基本步骤（以培育抗虫棉为例）：

1.培育转基因抗虫棉的技术流程：

⑴提取目的基因（抗虫基因）：

⑵目的基因与运载体结合：

⑶目的基因导入受体细胞：

⑷目的基因的检测与表达：

2.重点理解基因工程基本内容的五个要点：

⑴基因工程的基本内容大致是：

① 提取目的基因：获取目的基因是基因工程研究和应用的关键内容之一。获取原核细胞的目的基因通常用鸟枪法，也可以用人工合成法。获取真核细胞的目的基因一般用人工合成法。单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法苏云金芽孢杆菌

（供体细胞的DNA ） 许多DNA 片段 （含有抗虫基因） 质粒 （运载体） 限制酶

含抗虫基因的细胞 载入 扩增 培养选择

含重组质粒的土壤农杆菌 离体棉花叶片组织（受体细胞）

侵 染 离体棉花叶片组织

（受体细胞） 愈伤组织 再生植株

转基因抗虫棉植株

（表现出特定性状）

分化 诱导选择 检测

对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增。然后再根据不同的方法将所需的克隆基因筛选出来，最后分离得到目的基因。故获取的目的基因需要进行扩增和分离（方法多种且复杂）。

②将目的基因与运载体结合：用同一种限制酶切割运载体与目的基因，再将目的基因与能够自我复制并具有选择标记的运载体在体外利用连接酶连接，形成重组DNA分子。限制性内切酶和连接酶是基因工程关键的工具酶。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。

③将目的基因导入受体细胞：用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。目的基因进入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制。目的基因与运载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组DNA 分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。如转基因动物的培育常用受精卵作为受体细胞。

④目的基因的检测和表达：在全部受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的，因此，必须通过一定的手段，对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。又因为目的基因导入受体细胞后不一定能表达（目的基因沉默）或不能高效表达，有时需要用DNA修饰酶对目的基因的进行修饰（编码区除外）方能表达。所以，重组DNA 分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。因为基因能通过转录、翻译得到相应的多肽或蛋白质，再通过多肽或蛋白质的性质体现生物的性状。

⑵基因工程的核心技术是DNA扩增（也称分子克隆，即目的基因在受体细胞内进行无性繁殖或利用PCR技术），其次是外源基因（目的基因）的高效表达。

⑶“鸟枪法”适于从简单基因组中分离目的基因。而要获取真核细胞的目的基因时，一般用人工合成基因的方法。这是因为高等真核生物的基因组DNA十分庞大，基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列外，还含有不表达的片段（内含子），除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。不能直接用于基因的扩增和表达。

⑷目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于运载体。因此运载体在基因工程中占有十分重要的地位。运载体必须具备的条件有：能够在宿主细胞中复制并稳定保存；具有多个限制酶切点（指的是有多种限制酶的切点，但每种限制酶的切点最好只有一个，且酶切位点不影响运载体的复制），以便与多种外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。如一个质粒作为运载体最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的与目的基因结合的位点，当目的基因插入这个位点后，标记基因失活，成为选择目的基因的依据。

⑸基因工程最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间，动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌中表达，细菌的基因可以转移到植物中表达。