神经通路示踪技术 尼式染色

Nissl染色程序： 切片入0.1%尼氏液中染色5至10分钟 蒸馏水洗去染液 70%酒精分色 1分钟 80%酒精 1-2分钟 90%酒精 1-2分钟 100%酒精 2分钟 100%酒精 2分钟 二甲苯 2分钟 二甲苯 2分钟 中性树胶封片
⒉ 苏木精伊红染色法( hematoxyiln eosin， HE ) 本法是组织学最常用的染色方法，它可显示组 织内各种细胞结构，HE染色在神经生物学研 究中亦常采用，苏木精是阳离子染料，可将细 胞核内的嗜碱性物染成蓝紫色，伊红是阴离子 染料，可将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。
5．冷冻干燥切片(freezing drying sectioning)： 将新鲜组织放入经液氮预冷（-160℃）的异戊 烷中骤冷后，入真空内干燥，已干燥的组织块 进行真空包埋后切片。其特点是细胞在骤冷的 同时立即停止一切生物化学变化，可研究骤冷 时细胞内的物质变化状况。 6．超薄切片(ultrathin sectioning)：通过固定、 脱水、包埋、切片和染色等步骤。固定分预固 定和后固定。包埋剂多为环氧树脂。切片用醋 酸铀及枸橼酸铅进行电子染色，在电子显微镜 下观察。
6．免疫电镜技术
免疫电镜技术（immunoelectron microscope technique）是免疫细胞化学与电子显微技术结合 的产物，用以在超微结构水平进行免疫细胞化学 研究。 此技术的关键问题是标记物质必须是能满足电镜 显微技术要求的电子致密物质，目前常用的为 HRP、细胞色素C，近年来随着胶体金、纳米金 技术的发展，更广泛的被采用作为免疫电镜的标 记物。
4．免疫细胞化学的双重标记（Double staining）
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这一技术目的是在同一神经细胞胞体或它的突起内同时显 示共存的两种或两种以上物质以研究这些物质在同一神经 元或它的突起内的共存现像，或含有不同化学物质的两种 结构的相互关系。
5．荧光细胞化学双标记法
荧光细胞化学双标记法的原理亦如免疫细胞化 学双标记方法，只是第二抗体标记物是不同的 荧光素，如呈黄绿色荧光的FITC及呈红色荧光 的TRITC，可将两种不同的特异性一抗混合与 切片进行孵育，但两种一抗必须来自不同种动 物。然后再与标记不同荧光素的两种针对第一 抗体的二抗混合孵育，使各自与一抗结合。最 后在荧光显微镜下用不同的激发滤片观察到两 种不同反应产物的不同的荧光。
神经组织的固定
（一）固定(fixation) 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组 织自溶，必须对细胞和组织进行固定。固定的作用不 仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源 性酶活性。更重要的是最大限度的保存细胞和组织的 抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原防止抗原 弥散。 （二）固定剂(fixative) 醛类固定剂 双功能交联剂，使组织之间相互交联，保存抗原于原 位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。常用的醛 类固定剂有10%钙-福尔马林液，10%中性缓冲福尔马 林液，4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸缓冲液， 戊二醛(Glutaraldehyde)-甲醛液，Bouin’s液等

步骤: 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟; 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟; 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟 100%的酒精去二甲苯5分钟; 100%的酒精去二甲苯5分钟 90%的酒精水化2分钟; 80%的酒精水化1分钟; 70%的酒精水化1分钟 用蒸馏水洗; (以上步骤统称为脱蜡至水) 0．5%的苏木精染色，室温5—10分钟； 水洗； 1%的盐酸酒精分色30—60秒； 水洗； 流水促蓝；
2．免疫细胞化学方法 免疫细胞化学方法(Immunocytochemistry)是应用免疫 学原理，通过抗原与特异性标记抗体结合，从而显示 细胞内的抗原或抗体成分。这种方法可以定位或示踪 细胞内各种成分，包括各种蛋白质、多肽、部分类脂 质和多糖以及细胞膜表面的膜抗原和受体等等。由于 在组织细胞内进行的抗原抗体结合是不可见的，故需 要在抗体上结合一定的可见的标记物质。

1%的伊红室温染色2-5分钟； 水洗； 70%的酒精分色30—60秒； 80%的酒精脱水1分钟； 90%的酒精脱水1分钟； 100%的酒精脱水2钟； 100%的酒精脱水2钟； 二甲苯Ⅰ透明5分钟； 二甲苯Ⅱ透明5分钟； 中性树胶封片。 结果： 1． 细胞质染成红色 2． 细胞核染成蓝色
3．荧光免疫细胞化学
荧光免疫细胞化学( immunofluorescent cytochemistry)的基本原理是用荧光染料作 为标记物，标记上己知的抗原或抗体，再 用标记上荧光素的抗体或抗原作探针，检 测细胞或组织内的相应抗原或抗体。当荧 光素结合的抗体与被检抗原或抗体结合， 便可用荧光显微镜检测到这此抗原或抗体 的定位。
神经细胞化学性质显示方法
1．组织化学方法 （1）显示脱氧核糖核酸的孚尔根反应法(Feugen reaction) 利用schiff试剂显示细胞内DNA的经典方法， 其基本原理是组织经盐酸水解后打开DNA分子中脱氧 核糖和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出脱氧核糖核 酸中的醛基，醛基与schiff试剂中的亚硫酸品红结合， 而在核内呈红色反应沉淀物。 （2）显示多糖的过碘酸-schiff反应法(Periodic acid Schiff reaction)简称PAS法，是显示组织或细胞内多 糖和粘多糖成分的常用方法，其原理是通过碘酸的氧 化作用，打开糖分子内1，2-乙二醇中的碳-碳键或糖 中的的氨基，烃氨基衍生物，形成2-醛基，这些醛基 与schiff试剂中的亚硫酸品红反应，形成紫红色化合物。
其它固定剂： 酒精（alcohol） ： 使蛋白质脱水而致不可逆性的凝固变性。对组织有固定、硬化兼 脱水的作用 醋酸（acetic acid）： 对核蛋白有明显的沉淀作用，不能单独使用，常与酒精联合使用 苦味酸（picric acid）： 沉淀蛋白并溶解粘蛋白，使组织柔软。 铬酸（chromic acid） ： 强氧化剂，能沉淀所有蛋白。重铬酸钾是氧化剂，对蛋白和脂类 有固定作用，尤其是脂类。对核蛋白有溶解作用。 氯化汞（mercury chloride） ： 沉淀各种蛋白。但必须脱汞 锇酸（osmium tetroxide） ： 强氧化剂。蛋白的固定作用较好，不发生沉淀，组织几乎不收缩。 但渗透力弱。 丙酮（acetone）
（三）固定方法
1.浸入法 将组织浸泡在固定液内。 2.灌注法 此法适用于动物实验研究。
常用的切片方法
常用的有石蜡切片法、冰冻切片法、恒冷箱切片法、 振动切片法. ⒈ 石蜡切片(paraffin sectioning) 本法是将已固定的组织块常规脱水处理后，放入熔化 的石蜡中浸蜡，将组织包埋在石蜡中制成蜡块，再用 石蜡切片机切片(一般片厚5-10µm)，然后将切片贴于 载玻片上。本法适用于一般染色方法。 ⒉ 冰冻切片(freezing sectioning) 本法是将已固定或未经固定的组织块经保护处理后， 用液态二氧化碳或半导体致冷装置迅速致冷冻结变硬， 然后在冰冻切片机上切片。本法可不必经脱水包埋处 理，甚至可不经固定处理，故对组织细胞内的脂类成 分及酶的活性影响较少，而且方法简单，制片速度快， 缺点是难以切出10µm以下的薄切片。
⒊ Weigert 氏髓鞘染色法 有髓神经纤维的髓鞘主要组成成分是磷脂，如 以铬盐或铁钒媒染使之与苏木精结合，再藉分 色处理，就能着色清晰，并在中枢神经系统显 示其分布状态。髓鞘染色除可用于显示神经纤 维干、束外，更多用于中枢神经系统纤维束的 追踪。因为，尚未髓鞘完全的纤维束（如婴儿 皮质脊髓侧束），或髓化受到损害而产生溃变 的纤维束，在与正常已髓化的纤维对比之下可 以区别。用劳克坚牢蓝（Luxol fast blue）类 染料染色也可显示髓鞘，操作时也较容易。但 染色作用较慢，染色也较浅。
⒋ 镀银法（silver impregnation ） 镀银法又名浸银法，是用硝酸银镀染神经元，一个多 世纪以来，镀银法为神经形态学的发展作出了重大贡 献，此法于上一世纪七十年代由意大利解剖学家Golgi 创建，故称为Golgi氏法。到目前Golgi原法己有许多改 良法，经Cox改良的Golgi-Cox法，可以较好地显示神 经元胞体、突起各部形态，是多年来较受欢迎的方法 之一。
免疫组织化学染色 SP法 1）脱蜡、水化；（石蜡切片，冰冻切片免此步骤） 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（甲醇）滴加在切片上，室温静置20分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；（石蜡切片，冰冻切片免免此步骤） 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟； 14）Ⅲ抗30分钟； 15）PBS洗3次各5分钟； 16）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 17）PBS或自来水冲洗10分钟； 18）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 19）自来水冲洗10～15分钟； 20）脱水、透明、封片、镜检。
（3）显示脂类的脂溶性染料法 显示脂类通常用易溶 于脂类的染料，使之溶于组织或细胞内的脂滴内而显 色. 常用的这类染料有: 苏丹III (Sudan III)，苏丹IV (Sudan IV)，苏丹黑B (Sudan black B)，油红O (oil red O)等。 （4）显示酶的酶细胞化学方法 酶显示法是显示酶的 活性而不是酶的本身，细胞内含有多种酶，每一种酶 都可催化一定的化学反应。酶显示法的基本原理是具 有酶活性的组织切片或涂片，在含有酶作用底物和捕 获反应产物的捕捉剂的孵育液中，经一定pH及一定温 度的孵育，底物被酶催化分解后形成的初级反应产物 被捕捉剂捕捉，并在原位沉淀，形成有色的最终产物。
⒊ 恒冷箱切片法(cryostat sectioning) 本法是在冰冻切片技术基础上发展起来的切片 技术，其特点是将己固定或未经固定的组织块 冷冻处理后，在低温恒冷箱中进行切片，由于 切片机装在恒冷箱内，整个切片过程在低温环 境下进行，故能更好地保存组织内各种活性物 质，并可切出较薄切片，此法特别适用于细胞 化学及免疫细胞化学研究。 ⒋ 振动切片法(vibration sectioning) 本法是用特殊的振动切片机进行切片，振动切 片机的特点是其刀片进行横向切割运动， 故可 切割新鲜未经冰冻，末经固定的组织，切片厚 度可达10µm。常用于免疫细胞化学、免疫电 镜及电生理学脑厚片技术。
神经组织的一般染色方法
⒈ 尼氏法（Nissl staining） 尼氏体（Nissl body）也被称作“嗜色小体” 或“虎斑小体”，其主要成份是核糖核酸 （RNA）和蛋白质组成。在各种类型神经元中， 尼氏体的形状、大小与分布均不相同。由于含 有RNA，故易为某些碱性苯胺染料所染色（如 甲苯胺蓝，焦油紫类，硫堇，天青，派洛宁， 中性红以及培花青等）。本法除可显示正常神 经元形态，特别是其内含的尼氏体情况外，还 可显示当神经元受到损害，引致的尼氏体消失， 即染色质溶解（chromatolysis），可供病理或 临床诊断和实验研究参考。